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抗菌肽Defensin真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的Defensin基因的cDNA全长编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以阳离子脂质体Lipofect AmineTM 2000转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定转染的阳性克隆细胞,以RT-PCR分析其mRNA的转录情况,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以Western免疫印迹鉴定蛋白质表达情况.结果 构建了pcDNA3.1 (+)-Defensin-His表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.RT- PCR从阳性克隆CHO细胞系中扩增出320 bp大小的目的片段,从转录水平证实pcDNA3.1(+)-Defensin-His重组细胞株表达了Defensin基因.Western免疫印迹检测可见相对分子质量为10000的阳性条带,表明Defensin-His在该细胞系中成功表达.结论 成功构建了质粒pcDNA3.1(+)-Defensin-His,并获得了稳定表达的CHO-Defensin细胞株,有利于进一步研究家蝇幼虫抗菌肽Defensin基因的生物学功能.
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抗菌肽及其模拟物的临床应用研究进展
抗菌肽,作为一种新型的抗生素替代药物,近年来得到了极大关注.本文概述了抗菌肽及其模拟物的抗菌特性及优势特点,着重阐述了其临床研究进展和临床应用面临的挑战.抗菌肽具有不同于传统抗生素的独特抗菌机制,能够杀灭多重耐药菌且不易诱导产生抗药性,数十种抗菌肽已进入了临床试验阶段,但是毒性作用、不稳定性及成本昂贵使其临床应用受到限制.针对上述缺陷,研究者尝试合理改造抗菌肽的结构,并着手研发抗菌肽模拟物.相信在未来,抗菌肽及其模拟物会在对抗耐药菌方面发挥重要的作用.
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Cathelicidin LL-37抗菌修复作用及机制的研究进展
抗菌肽Cathelicidin LL-37(简称LL-37)是人体先天免疫系统的重要组成部分,广泛存在于机体的多个器官及组织中,可以直接参与调节机体炎症的发生、发展,或通过巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞间接调控机体防御功能,在机体的防御功能中扮演重要角色,同时LL-37可以促进受损组织的修复与再生.本文广泛查阅LL-37的直接、间接抗菌作用及其机制,LL-37通过促血管新生,细胞迁移、增殖分化等作用,进而加速细胞修复的相关文献后,进行总结分析,对抗菌肽LL-37抗菌及修复功能机制方面的相关研究进展作一综述.
关键词： 抗菌肽类 内源性抗菌多肽类物质 LL-37 修复 -
创面感染的防治策略
创面感染是常见的创面并发症,也是引起创面延迟愈合的重要因素.近年来,生物膜在创面感染中的作用得到广泛关注,针对于此,在传统创面治疗的基础上,涌现了抗菌肽、超声水刀、负压创面治疗、高压氧治疗等新药物、新技术,形成了基于生物膜的创面治疗策略.
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钛种植体载抗菌肽涂层的抗菌性及其对成骨细胞活性的影响
目的 探讨钛种植体表面载抗菌肽涂层对牙龈卟啉单胞菌的抗菌性及其对成骨细胞黏附、增殖的影响,为构建具有抗菌功能及良好生物活性的口腔种植体功能性生物涂层提供依据.方法 纯钛试件经超声微弧氧化、碱处理、硅烷化处理后,分别加入0.25、0.50、0.75g/L抗菌肽Pac-525得到3组抗菌肽组试件,对照组钛试件仅进行超声微弧氧化、碱处理和硅烷化处理(每组样本量均为45).用扫描电镜及能谱分析仪观察各组涂层形貌并分析元素变化,吖定橙-溴化乙锭双染色检测各组试件与牙龈卟啉单胞菌共培养72 h后的活菌平均百分比和生物膜厚度,细胞计数试剂盒检测成骨细胞增殖情况,免疫荧光染色观察成骨细胞黏附数量及生长形态.结果 扫描电镜观察可见抗菌肽颗粒嵌入涂层表面的微孔中,各抗菌肽组C、N元素均明显多于对照组;对照组、0.25、0.50、0.75 g/L抗菌肽组的活菌平均百分比分别为0.58％、0.45％、0.34％和0.28％,各组间差异均有统计学意义(P＜0.05).0.50和0.75 g/L抗菌肽组牙龈卟啉单胞菌的生物膜厚度[分别为(98.3±1.2)和(94.5±2.5)μm]均显著小于对照组和0.25 g/L抗菌肽组[分别为(117.6±1.5)和(118.0±1.3)μm](P＜0.05);各抗菌肽组成骨细胞的黏附和增殖数量均显著大于对照组(P＜0.05),且细胞铺展较好.结论 钛种植体载抗菌肽涂层可阻碍细菌生物膜生成,有较好的抗菌性且具有促进成骨细胞黏附及增殖的作用.
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钙泊三醇对人角质形成细胞S100A8基因表达的影响
目的 探讨钙泊三醇对人角质形成细胞抗菌肽S100A8基因表达的影响.方法 体外培养的HaCaT细胞,分为空白对照组、加入100 ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)的TNF-α组、加入10-5 ～ 10-9 mol/L钙泊三醇的钙泊三醇组、TNF-α与钙泊三醇共同刺激的TNF-α+钙泊三醇组,所有细胞共同孵育24 h.实时定量PCR法检测并计算S100A8 mRNA相对表达量.结果 100 ng/mlTNF-α处理HaCaT细胞后24 h,S100A8 mRNA表达较空白对照上调(19.623 ±3.486)倍(P＜0.01);10-7、10-8 mol/L钙泊三醇处理细胞24 h后,S100A8表达分别较空白对照上调(5.029±1.056)、(2.848 ±0.612)倍(均P＜0.01).10-5 mol/L钙泊三醇与TNF-α共同处理细胞后,S100A8表达下调为单独使用TNF-α时的(59.51±3.31)％(P＜0.05);10-7 mol/L钙泊三醇与TNF-α共同处理细胞后,S100A8表达较单独使用TNF-α时上调(1.873 ±0.153)倍(P＜0.01).结论 TNF-α可以诱导体外培养的角质形成细胞高度表达S100A8.钙泊三醇双向调节角质形成细胞S100A8表达:高浓度(10-5 mol/L)钙泊三醇下调S100A8表达,低浓度(10-7～10-8mol/L)钙泊三醇上调S100A8表达.
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pORF5质粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增强沙眼衣原体感染的初步研究
目的 探讨pORF5质粒蛋白能否通过抑制LL37抗菌肽增强沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)感染,并初步探讨其分子机制.方法 表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切制备不含GST标签的pORF5蛋白;pORF5蛋白和LL37单独或共孵育衣原体后再感染HeLa细胞,间接免疫荧光技术计数衣原体包涵体形成数量;荧光定量PCR检测TNF-α、LL37基因表达水平.结果 单独Ct感染组衣原体包涵体形成单位(IFU)为3.8×105/ml,LL37处理组IFU为2.0 × 105/ml,pORF5蛋白处理组IFU为3.0×105/ml,pORF5蛋白和LL37共处理组IFU为3.1×10/ml.pORF5蛋白处理组、LL37与pORF5蛋白共处理组和单独Ct感染组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但明显高于LL37单独处理组(P＜0.05).pORF5蛋白和LL37共同处理组TNF-α表达水平明显高于LL37单独处理组(P＜ 0.01);pORF5蛋白处理组较Ct处理组LL37基因转录水平下降了19％.结论 pORF5质粒蛋白能拮抗LL37抗菌肽增强Ct感染,其机制可能与上调肿瘤坏死因子α、下调LL37表达相关.
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人脐带间充质干细胞培养上清液与环丙沙星体外联合应用对金黄色葡萄球菌的作用
目的 探讨联合应用人脐带间充质干细胞(hUCMSC)培养上清液与环丙沙星对金黄色葡萄球菌的作用. 方法 取足月剖宫产健康胎儿的脐带组织,分离、培养、鉴定hUCMSC后选取第3代细胞进行实验;取笔者单位烧伤患者创面分离培养的金黄色葡萄球菌菌株用于以下实验.按随机数字表法(下同)将细胞分为0、10、100、1 000 ng/mL LPS组,添加相应质量浓度LPS处理12h后,换为间充质干细胞(MSC)培养液培养,培养6、12、24 h,每组收集6孔细胞培养上清液,ELISA法测定LL-37含量.将90个血琼脂平板培养基分为环丙沙星对照组、环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组,每组30个.环丙沙星对照组培养基涂布1.5×108 CFU/mL生理盐水配制的菌液;环丙沙星+上清液组培养基涂布1.5×108 CFU/mL由生理盐水和2倍生理盐水体积的hUCMSC培养上清液(用MSC培养液培养,下同)配制的菌液;环丙沙星+上清液+LL-37抗体组培养基涂布1.5×108 CFU/mL由生理盐水和2倍生理盐水体积的hUCMSC培养上清液配制的菌液,菌液中加入2 μg/mL LL-37抗体2.6 μL.培养12、24、48 h,每组取10个血琼脂平板培养基,观察血琼脂平板培养基上金黄色葡萄球菌菌落分布情况,测量环丙沙星抑菌环直径,读取环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MIC.计算环丙沙星+上清液组和环丙沙星+上清液+LL-37抗体组培养12、24、48 h时环丙沙星的部分抑菌浓度(FIC)指数并评定协同效果.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验. 结果 (1)培养各时相点,10、100、1 000 ng/mL LPS组细胞培养上清液中LL-37含量均较0 ng/mL LPS组高(t值为11.22 ～33.36,P值均小于0.01),100、1 000 ng/mL LPS组细胞培养上清液中LL-37含量均较10 ng/mL LPS组高(t值为2.24 ～ 18.73,P ＜0.05或P＜0.01),1 000 ng/mL LPS组细胞培养上清液中LL-37含量均较100 ng/mL LPS组高(t值为12.46 ～14.70,P值均小于0.01).(2)培养12、24、48 h,环丙沙星对照组、环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组血琼脂平板培养基中细菌菌落随时间延长逐渐融合.环丙沙星对照组培养12、24、48 h环丙沙星抑菌环直径变化不大,分别为26、24、23 mm.环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组培养12、24、48 h环丙沙星抑菌环直径分别为82、71、68 mm和74、59、56 mm,明显大于环丙沙星对照组.(3)培养各时相点,环丙沙星对照组环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MIC明显大于环丙沙星+上清液组和环丙沙星+上清液+LL-37抗体组(Z值为6.22～6.71,P值均小于0.01);环丙沙星+上清液+LL-37抗体组环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MIC均明显大于环丙沙星+上清液组(Z值均为6.72,P值均小于0.01).(4)环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组培养12、24、48 h时环丙沙星的FIC指数分别为0.011、0.032、0.032,0.122、0.350、0.350,即hUCMSC培养上清液对环丙沙星产生了协同抗菌作用. 结论 hUCMSC能够分泌LL-37且分泌水平随着LPS浓度的增加而提高.hUCMSC培养上清液联合环丙沙星抗金黄色葡萄球菌,可以有效降低环丙沙星用量,中和LL-37后,hUCMSC培养上清液的协同抗菌作用降低.
