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白念珠菌RAS1基因高表达菌株的构建及鉴定
目的：构建白念珠菌RAS1基因高表达菌株pCaEXP?RAS1?CAI4。方法：将白念珠菌RAS1基因的开放阅读框（ ORF）置于高表达载体pCaEXP的启动子MET3之后，构建高表达质粒载体pCaEXP?RAS1。将整合的重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α，经扩增后采用质粒抽提试剂盒大量制备pCaEXP?RAS1质粒。单酶切线性化质粒，将线性化的pCaEXP?RAS1经醋酸锂法转化入白念珠菌CAI4细胞内，随后在SD?ura?met?cys选择性培养基获得转化子，构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。挑取单克隆菌落，经菌落PCR验证阳性转化子，并采用实时定量PCR检验RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平。结果：酶切及测序鉴定表明高表达质粒载体pCaEXP?RAS1构建成功，实时定量PCR检验转化子RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平，表明pCaEXP?RAS1?CAI4菌株构建成功。结论：通过高表达质粒载体pCaEXP?RAS1可以成功构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。
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不同筛选标记法构建白念珠菌RAS1基因敲除株的比较
目的 采用两种筛选标记法(HIS-LEU-ARG基因敲除策略和URA-Blaster法)分别构建白念珠菌RAS1基因敲除株,并对两种方法的成功率进行比较.方法 HIS-LEU-ARG基因敲除策略中,以SN152菌株基因组DNA、筛选标记DNA为模板,采用融合PCR技术构建融合基因片段.URA-Blaster法中,以CAI4基因组DNA、hisG-URA3-hisG基因敲除盒为模板,运用无缝克隆技术构建RAS1基因敲除质粒.随后,分别将上述两种方法得到的融合基因片段和质粒线性化产物转染至白念珠菌SN152、CAI4细胞内,在营养缺陷培养基上获得阳性转化子,通过2次同源重组敲除RAS1两条等位基因.结果 采用HIS-LEU-ARG基因敲除策略成功构建RAS1双等位基因敲除株.而采用 URA-Blaster方法,重复多次均未能成功构建白念珠菌RAS1双等位基因敲除株.结论 HIS-LEU-ARG基因敲除策略比URA-Blaster法更适用于RAS1基因敲除株的构建.
