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重组Reg3α蛋白促进胰岛β细胞增殖活性及其机制的研究
构建了鼠源Reg3α蛋白基因工程表达菌E.coli(T7 Expression),经IPTG诱导以包涵体形式表达.通过菌体裂解、洗涤和镍柱亲和层析等纯化步骤,SDS-PAGE和HPLC鉴定制得的重组Reg3α蛋白纯度为97.6％.细胞MTT和BrdU标记检测显示重组Reg3α蛋白能有效促进MIN6细胞和原代胰岛的增殖,Western blot方法证明其能够显著提高Erk1/2和Akt信号分子的磷酸化水平从而刺激细胞增殖.在重组Reg3α蛋白抵抗链脲霉素(Streptozotocin,Stz)诱导MIN6细胞凋亡实验中,未能检出剪切型Caspase-3水平的降低,但MTT结果显示其能维持活细胞数量.在毒胡萝卜内酯(Thapsigargin,Tg)诱导MIN6细胞内质网应激反应(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)实验中,重组Reg3α蛋白能有效降低剪切型Caspase-3水平,同时增强关键分子伴侣GRP78的表达从而抑制细胞凋亡.重组Reg3α蛋白具有作为外源性药物促进胰岛β细胞增殖、抗凋亡的活性,具备根治糖尿病药物研究的潜力.
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糖脂毒性作用下小鼠胰岛miRNA的表达谱变化
目的：初步探索长期高糖和／或高脂培养对小鼠原代胰岛中miRNA表达的影响。方法选取B6小鼠原代胰岛作为研究对象，提取RNA后通过生物芯片高通量筛选法及RT-PCR法检测并统计胰岛中表达水平变化的miRNA种类；生物信息学方法预测变化显著的miRNA的下游靶基因并通过Western印迹法验证预测结果。结果生物芯片与定量PCR结果均显示，高糖和／或高脂培养后原代胰岛中相当一部分miRNA的表达发生了显著改变，其中miR320在高糖、高脂和高糖高脂联合培养下表达均呈上升趋势，通过生物信息学方法预测p85α为其下游靶基因，干扰小鼠胰岛β细胞系中miR320表达后p85α表达明显下降。结论在本实验中，高糖和／或高脂培养会引起原代胰岛中miR?320的表达水平升高，提示miR?320可能通过参与免疫系统的调控从而对2型糖尿病的发生发展产生作用。
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糖化终末产物刺激胰岛中NADPH氧化酶水平升高
目的：研究体外糖化终末产物（AGEs）对大鼠胰岛NADPH氧化酶表达的影响。方法：分离大鼠胰岛，用AGEs 刺激胰岛细胞2、12、24、48 h，采用实时荧光定量PCR检测Nox2表达水平的变化，化学发光法检测 NADPH 氧化酶活力。结果：AGEs 作用12、24 h 后，Nox2 mRNA 水平较对照组分别上升1．75、2．31倍（P＜0．05），随着AGEs作用时间的延长，NADPH 氧化酶活力逐渐升高，24 h 时达高，后有所下降，但仍高于对照组。结论：糖化终末产物作用于胰岛后导致NADPH氧化酶活性增加，进而引起胰岛损害。
