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MicroRNA-195与Smad7靶向关系的研究
目的：构建含有Smad7基因3′-UTR区的荧光素酶报告基因载体，利用双荧光素酶报告基因验证MicroR-NA195与其潜在靶基因Smad7的靶向关系。方法：PCR扩增出Smad7基因3′-UTR区片段，以此构建含3′-UTR的荧光素酶报告基因载体（wild type，WT）；将miRNA-195与荧光素酶报告重组子共转染至293T细胞中，双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性；构建含Smad7基因3′-UTR突变体（mutant，Mut）的荧光素酶报告基因质粒，检测荧光素酶活性变化。结果：测序结果表明，含有Smad7基因3′-UTR区的荧光素酶报告基因载体构建正确；荧光素酶活性实验表明，与对照组相比，miRNA-195可使含Smad7基因3′-UTR区的荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低40％左右；而定点突变Smad7基因3′-UTR的荧光素酶报告重组子荧光活性未有明显变化。结论：成功构建了Smad7基因3′-UTR区的荧光素酶报告基因载体，而miRNA-195可以直接作用于Smad7基因3′-UTR区，抑制其荧光素酶活性。
关键词： MicroRNA195 Smad7基因 荧光素酶报告基因 3′-UTR -
靶向人Beclin1非编码区小分子干扰方法的建立及效果评价
目的 建立靶向人Beclin1非编码区小分子干扰(siRNA)的方法并对其效果进行评价.方法 设计分别靶向人Beclin1 mRNA不同区域的siRNA:靶向5′-UTR的siRNA-#1、靶向3′-UTR的siRNA-3#和siRNA-4#,及靶向编码区的阳性对照siRNA-2#.各siRNA转染HEK293细胞48 h后,蛋白印迹法检测Beclin1及自噬标记蛋白LC3的变化;或者采用双荧光mRFP-GFP-LC3(tfLC3)质粒再转染24 h,荧光显微镜观察并统计细胞内红色及黄色LC3亮点的变化.结果 转染siRNA后,特异靶向3′-UTR的siRNA-3#和siRNA-4#及靶向编码区的siRNA-2#(阳性对照)能显著抑制HEK293细胞的Beclin1和LC3的蛋白表达;并导致自噬体(黄色亮点)及自噬溶酶体(红色亮点)明显减少.结论 采用靶向3′-UTR的特异siRNA可成功敲低(knock-down)人Beclin1的表达,并减少细胞自噬活性.成功建立的3′-UTR特异siRNA方法,为以后干扰和突变体共表达研究提供基础.
