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GST Pulldown技术检测HEK293T细胞活化的Rab35
目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中活化的Rab35的可靠检测方法.方法:构建GST-RUN的原核表达载体,并使其在大肠杆菌B L21中大量表达.用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Rab35及Rab35蛋白的表达.结果:成功构建了GST-RUN的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RUN,用GSTPulldown和Western blot技术证实了HEK293T细胞中有活化的Rab35和Rab35总蛋白的表达.结论:本工作所建立的GSTPulldown技术可以检测HEK293T细胞中活化的Rab35,从而为进一步深入研究Rab35在真核细胞中的功能提供了技术保障.
关键词： GST pulldown HEK293T Rab35 真核细胞 -
GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性
目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法.方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达.用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达.结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达.结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障.
关键词： GST pulldown HEK293T Daam1 真核细胞 -
氯离子通道蛋白1的缺失突变体CLIC1(△49-51)与Sedlin蛋白相互作用的研究
目的 探究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的缺失突变体CLIC1(△49-51)在哺乳动物细胞中的表达、定位改变,及与Sedlin蛋白在体内、体外相互作用的影响.方法 构建CLIC1的缺失突变体的真核表达质粒pcDNA3.1-CLIC1(△49-51)-FLAG;免疫荧光观察CLIC1(△49-51)与Sedlin在COS7细胞中的共定位;在HEK 293T细胞中进行免疫共沉淀和GST pulldown实验,研究CLIC1(△49-51)与Sedlin的相互作用.结果 CLIC1(△49-51)在COS7细胞中主要定位于细胞质,小部分定位于细胞核.相对于野生型CLIC1的细胞核定位,缺失突变体的细胞内定位发生明显改变并且与Sedlin蛋白没有共定位.Western blot结果显示CLIC1(△49-51)能在HEK 293T细胞中有效表达;免疫共沉淀实验结果表明其与Sedlin在体内没有相互作用;GST pulldown结果表明其与Sedlin在体外没有相互作用.结论 CLIC1蛋白的第49～51位氨基酸序列KRR对CLIC1蛋白在细胞内的正确定位发挥重要作用;其缺失突变后影响了CLIC1在细胞内的定位、表达及CLIC1与Sedlin的相互作用.
关键词： CLIC1缺失突变体 免疫荧光 免疫共沉淀 GST pulldown
