首页 > 文献资料
-
新型荧光薄层层析-分光光度计测定细胞内GCS酶活性
目的:通过建立一种新型的荧光薄层层析.分光光度法,精确而直接测定细胞内葡萄糖神经酰胺合酶GCS的活性,以评价其对耐药性肿瘤细胞的作用.方法:加入不同剂量的含荧光的NBD-C6-Ceramide,运用荧光薄层层析-分光光度法测定不同反应时间下人乳腺癌细胞MCF-7-AdrR中,葡萄糖神经酰胺(glucosylxeramide,GlcCer)和神经酰胺(ceramide,Cer)含量,计算两者的比值大小反映GCS酶活性情况,放射性酶学测定作为对照.Western-blot及免疫荧光分析MCF-7-AdrR及其转化细胞(MCF-7-adrR/GCS及MCF-7-adrR/asGCS)中GCS与P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表达关系.结果:研究表明5 μmol/L NBD-Cer是细胞内神经酰胺糖基化作用的佳浓度.糖基化作用随时问延长而增强,此方法精确测定MCF-7-AdrR各细胞及其它耐药型细胞中的GCS酶活性,MCF-7-adrR与MCF-7-adrR/GCS较药物敏感组MCF-7的糖基化作用(GC/Cer)明显增强(P均＜0.01),而在MCF-7-adrR/asGCS中糖基化作用急剧下降(P＜0.01).放射性酶学测定结果与之相符.Western-blot及免疫荧光显示GCS表达与耐药标志物P-gp表达在MCF-7-AdrR各细胞中呈明湿相关.结论:不同于传统的同位素酶学测定,这种新型荧光薄层层析.分光光度法,是测定细胞内神经酰胺糖摹化作用的一种简单易行、重复性好的实验方法,为进一步应用于耐药性肿瘤的体内实验奠定基础.
-
GCS和MDR-1基因在CML中的表达及意义
目的 观察慢性粒细胞白血病(CML)患者葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)和多药耐药1(MDR-1)基因的表达变化及其意义.方法 建立实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测0CS、MDR-1和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的方法,检测CML初发组25例和急变组25例患者外周血GCS、MDR-1基因表达水平,以GAPDH为内参基因,两组基因表达水平的差异采用△△CT相对定量法.结果 外周血GCS水平CML急变组较初发组显著增高(4.84倍,P＜0.01),MDR-1表达CML急变组9例阳性(36%),CML初发组均为阴性.结论 GCS和MDR-1基因高表达在CML急变患者的多药耐药中起着重要作用,其水平检测可为CML急变预后判断的新指标.
