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人完整p53凋亡刺激蛋白家族抑制成员多克隆抗体的制备及鉴定
目的:p53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族可调节p53抑癌功能,其抑制成员(iASPP)具有特异性抑制p53诱导细胞凋亡的能力.为了对iASPP进行系统研究,文中报道制备完整的iASPP分子多克隆抗体的方法.方法:在完整iASPP独有的N端选择3个免疫原肽段,制备了3个多克隆抗体.用ELISA检测抗体效价,Western blot比较3个抗体检测内源性抗原的效果,并用体外转录翻译系统制备的完整iASPP蛋白作为对照标准.结果:1号抗体效价＞1:32 000,2号和3号抗体效价＞1:16 000.Western blot确定100 000为完整iASPP蛋白的条带位置.结论:成功地制备了iASPP的多克隆抗体,为深入研究完整iASPP提供了有用的工具.
关键词： p53凋亡刺激蛋白家族抑制成员 多克隆抗体 免疫原 免疫印迹 -
iASPP真核表达载体构建及其功能鉴定
目的：构建P53凋亡刺激蛋白（ASPP）家族的抑制成员iASPP的真核表达载体，并将其通过脂质体转染到结肠癌细胞株SW480及Lovo中，观察转染前后iASPP 表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法将解放军第十六医院检验科经测序鉴定的pMD19-T-iASPP质粒亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋），构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-iASPP ，测序鉴定后用脂质体将重组质粒转染至结肠癌细胞株SW480及Lovo中，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测iASPP的表达以及用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化情况。结果重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-iASPP ，经酶切测序与GenBank上记录的人iASPP cDNA序列（gi 60457962）完全一致。经pcDNA3．1（＋）-iASPP质粒转染的结肠癌细胞株SW480及Lovo的iASPP mRNA表达增高，细胞凋亡率下降。结论成功构建了重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-iASPP ，并成功在结肠癌细胞株SW480及Lovo中获得了表达，细胞株的凋亡率下降，提示抑制iASPP高表达有可能成为恢复P53抑癌功能的新策略。
关键词： p53凋亡刺激蛋白家族抑制成员 遗传载体 转染 细胞凋亡
