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人单纯疱疹病毒加强型绿色荧光蛋白真核表达系统的构建及表达
目的:构建人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)加强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达系统,用于HSV感染的快速诊断. 方法:通过PCR扩增HSV-2启动子 ICP10目的基因片段,克隆至真核表达载体pEGFP-1,构建重组质粒pICP10-EGFP,脂质体法转染Vero细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞株Vero-ICP10-EGFP.以不同量的HSV-2感染Vero-ICP10-EGFP细胞,分别于感染后6、8和10 h,于倒置荧光显微镜下检测EGFP荧光.同时以人巨细胞病毒和柯萨奇病毒感染Vero-ICP10-EGFP细胞,检测其特异性. 结果:构建的重组质粒pICP10-EGFP经DNA测序鉴定,表明重组正确.重组质粒pICP10-EGFP转染Vero细胞后,经G418长期筛选建立稳定转染细胞株Vero-ICP10-EGFP,感染HSV-2后6 h,倒置荧光显微镜下即可检测到EGFP荧光.人巨细胞病毒和柯萨奇病毒感染Vero-ICP10-EGFP细胞后6、10和24 h,均未检测到特异性荧光. 结论:成功构建了HSV-EGFP真核表达系统,其具有早期、快速、灵敏等优点,特异性较高,可望用于HSV感染的快速诊断.
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单纯疱疹病毒2型DNA提取及ICP10启动子基因获得和纯化
目的 用单纯疱疹病毒2型DNA,扩增并纯化得到ICP10启动子基因.方法 培养vero细胞并接种HSV-2,获得大量HSV-2.用酚:氯仿提取病毒DNA,用PCR方法获得病毒ICP10启动子基因,并用UNIQ-10柱试剂盒纯化PCR产物.结果 接种病毒的vero细胞出现病变,病变为"()",收集细胞,反复冻融3次,使细胞裂解,获得大量HSV-2.经PCR扩增获得641bp大小的目的基因片段.电泳显示片断大小符合.结论 获得的ICP10启动子基因,经过测序正确后,可以和其他基因连接,用于进一步研究.
