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颅脑创伤后自噬表达的变化及bFGF保护作用的研究
目的 探索颅脑创伤后神经细胞自噬表达的变化及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的保护作用,为临床治疗脑外伤提供实验依据.方法 用雷帕霉素制作体外神经细胞自噬模型,观察在体外培养神经细胞中bFGF对自噬表达的影响.将150只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(假手术组、颅脑创伤组、bFGF治疗组),每组50只.精密颅脑损伤撞击器制作大鼠创伤性脑损伤模型,假手术组暴露硬脑膜而不撞击,bFGF治疗组于建模后10分钟由右侧侧脑室注入bFGF,而假手术组和创伤组在建模后10分钟由右侧侧脑室注入等量的生理盐水.应用大鼠行为学评分观察大鼠脑损伤后神经功能的变化;用干湿法测脑组织含水量;用免疫荧光显微镜观察神经细胞自噬表达的变化.结果 在体外培养细胞中,bFGF组能明显抑制雷帕霉素引起的LC3-Ⅱ表达增高(P<0.05).与假手术组相比,颅脑创伤组大鼠和bFGF治疗组的行为学评分明显降低(P<0.05),但bFGF治疗组的评分恢复快于颅脑创伤组(P<0.05).bFGF治疗组脑组织的含水量明显小于颅脑创伤组(P<0.05).与假手术组相比相比,颅脑创伤组和bFGF治疗组伤后LC3-Ⅱ蛋白表达均明显提高(P<0.05);与颅脑创伤组相比,bFGF治疗组LC3-Ⅱ的上调被明显抑制(P<0.05).结论 bFGF能明显抑制颅脑创伤后过度的自噬反应,减轻脑水肿,并改善大鼠神经功能.
关键词： 脑损伤 自噬 微管相关蛋白1轻链3(LC3) bFGF 雷帕霉素 -
蛛网膜下腔出血大鼠海马区MAPKs通路激活对神经细胞自噬的影响
目的 探讨大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路激活对神经细胞自噬的影响.方法 100只雄性SD大鼠分为假手术(Sham)组、模型(SAH)组、细胞外调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)抑制剂U0126组、p38MAPK抑制剂SB203580组、C-Jun氨基末端激酶(JNK)SP600125组.采用二次注血法制作SAH大鼠模型;HE染色观察海马区神经细胞的形态变化;实时荧光PCR法检测海马区ERK1/2、p38MAPK、JNK和自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的mRNA;免疫组化法检测海马区磷酸化ERK1/2、磷酸化p38MAPK、磷酸化JNK和自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白变化.结果 与Sham组比较,SAH中海马区神经细胞存活率在各时间点均降低[6 h:(84.982±5.723)％,24 h:(74.383±9.860)％,48 h:(62.860±10.820)％,72 h:(52.260±10.960)％]、ERK1/2、p38MAPK、JNK和LC3的mRNA表达增加(均P＜0.05);p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK和LC3-Ⅱ蛋白表达增加(均P＜0.05);与SAH组比较,U0126组海马区细胞存活率降低[6 h:(71.620±6.542)％,24 h:(66.221±7.742)％,48 h:(55.208±8.802)％,72 h:(46.242±7.782)％],ERK1/2 mRNA、LC3 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达降低;与SAH组比较,SB203580组海马区细胞存活率增高[6 h:(89.082±6.602)％,24 h:(85.840±9.726)％,48 h:(74.960± 10.916)％,72 h:(69.211±10.745)％],p38MAPK mRNA和p38MAPK蛋白表达降低,LC3 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达增多(P＜0.05);与SAH组比较,SP600125组海马区细胞存活率增高[6 h:(91.620±7.542)％,24h:(86.221±10.742)％,48 h:(75.208±11.802)％,72 h:(70.242±11.782)％],JNK mRNA和p-JNK蛋白表达降低,LC3 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达增多(均P＜0.05).结论 MAPK激活参与SAH后海马区神经细胞自噬,其中ERK1/2激活对SAH后海马区神经细胞自噬起到正性调控作用,而p38MAPK和JNK活化对自噬起负调控作用.
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四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎大鼠的实验研究
目的:通过膝骨关节炎大鼠模型研究四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎(KOA)大鼠的作用机制.方法:8周龄SD大鼠27只,随机分为正常对照组、KOA模型组、四妙散组,KOA模型组和四妙散组采用前交叉韧带切除法制作KOA模型,手术6周后四妙散组以四妙散药液灌胃,正常对照组和KOA模型组以生理盐水灌胃.连续灌胃4周后取膝关节软骨组织,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡细胞所占比例,采用荧光定量PCR检测关节软骨组织中凋亡和自噬相关基因表达水平.结果:与正常对照组比较,KOA模型组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著升高,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著升高,自噬相关蛋白LC3的表达显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与KOA模型组比较,四妙散组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著降低,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著降低,自噬相关蛋白LC3的表达显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:软骨细胞凋亡是KOA发病中的重要因素,该凋亡可能通过FADD-CASP3途径发挥作用.软骨细胞自噬作用的激活可抑制细胞凋亡,可能是延缓及控制KOA进展的一个新机制,四妙散可能通过该机制发挥治疗作用.
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脂多糖诱导脓毒症小鼠心肌细胞及线粒体自噬
目的 探讨脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平的变化.方法 雄性C57BL/J小鼠随机分为空白对照组(NC)、LPS处理6、12、24、36 h组.LPS处理组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS建立脓毒症模型,空白对照组注射等量生理盐水.分别于以上时间点处死小鼠,收集血液及心脏组织,提取心肌组织胞质蛋白、线粒体及线粒体蛋白,另取心肌组织进行冰冻切片;应用ELISA试剂盒测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量变化;JC-1染色结合荧光酶标仪检测LPS刺激后不同时间点线粒体膜电位变化;Westem blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、PTEN诱导激酶1(pink1)、E3泛素连接酶帕金森病蛋白(parkin)水平;免疫荧光组织化学染色检测心肌组织LC3、pink1/parkin蛋白的定位及其在不同处理组的表达差异.结果 与对照组相比,LPS诱导的脓毒症小鼠血清cTnⅠ在6h即开始明显升高;LPS处理组线粒体膜电位下降,在LPS 12 h组低;细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在腹腔注射LPS 12 h明显升高,然后逐渐下降;pink1/parkin在腹腔注射LPS6h明显升高,然后逐渐下降.结论 脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平升高,自噬应激可能更早发于心肌线粒体.
