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STAT1基因转染对人肺腺癌裸鼠移植瘤生长的影响
目的:探讨信号转导和转录活化因子1 (signal transduction and activators of transcription 1,STAT1)基因转染对肺癌移植瘤生长的影响.方法:构建稳定转染STAT1基因(转染组)及空载体(空载体组)的肺腺癌NCL-H1299细胞,使用未转染的细胞及上述两种转染细胞分别建立裸鼠皮下移植瘤模型,连续观察并测量肿瘤生长情况,Western blot法检测肿瘤组织内STAT1活化情况.结果:STAT1基因转染组裸鼠移植瘤接种33 d后瘤体积及瘤重小于未转染组及空载体组(均P＜0.05).Western blot检测结果提示STAT1转染组的肿瘤组织STAT1表达及磷酸化水平均明显升高.结论:STAT1基因转染可提高移植瘤组织内STAT1活化水平,并对肿瘤生长起抑制作用.
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STAT1基因与脑胶质瘤的研究进展
脑胶质瘤来源于神经上皮组织,是成人颅内常见的恶性肿瘤,可占全部脑肿瘤的一半以上.信号转导和转录激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription,STATs)家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6七个成员组成,STAT1是第一个被发现的STATs家族成员,研究表明STAT1是一种肿瘤抑制因子,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,其活性下降或缺失可导致恶性肿瘤的发生.本文就STAT1的结构和功能,以及在胶质瘤发生、发展和治疗中的研究进展作一综述.
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针对人STAT1基因的RNA干扰有效靶点的设计与筛选
目的:设计并筛选针对人STAT1基因有效的RNA干扰靶点.方法:根据人STAT1基因序列,设计3个干扰序列,将oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5a,进行测序验证.在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒.慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-time PCR检测干扰效果.结果:测序证实3个STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48 h后,STAT1基因在mRNA水平表达均受到抑制,其中MHCC9-L-stat1-shRNA-1序列效果佳,对STAT1基因表达的干扰效率可达81.4％.结论:成功构建并筛选了人STAT1基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究STAT1基因与抗肿瘤药物药效关系奠定基础.
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STAT1干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应测定
目的:构建STAT1基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并测定其基因沉默效应.方法:根据人STAT1基因序列,设计干扰序列,将Oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5 α,进行测序验证.在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒.慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-time PCR和Westem Blot检测RNAi组(MHCC97L-stat1-shRNA-1)和对照组(MHCC97L-stat1)中STAT1基因的表达情况,确定其干扰STAT1表达的有效性.结果:测序证实慢STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达明显降低.结论:STAT1基因RNAi慢病毒载体构建成功,能够在人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株中表达,并具有显著的基因沉默效果.
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STAT1过表达慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达
目的:构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达.方法:根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证.在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产幔病毒.慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用荧光定量PCR和Western blot检测原始细胞株(MHCC97L),稳转细胞株(MHCC97-stat1)中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性.结果:测序证实STAT1基因过表达载体构建成功.过表达慢病毒包装成功.慢病毒转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达显著增加.结论:STAT1基因过表达慢病毒载体构建成功,并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达.
关键词： 肝肿瘤 MHCC97L 细胞 STAT1基因 慢病毒载体 -
STAT1特异性siRNA真核表达载体的构建及体外转染优化
目的:构建STAT1特异性siRNA真核表达载体,并转染人气道上皮细胞(16HBE).方法:根据GeneBank数据库提供的STAT1基因两种变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,再转化为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)的DNA序列,并将其连接到带有卡那霉素抗性和增强绿包荧光蛋白的pGenesil-1.1真核表达载体上,将其转染至气道上皮(16HBE)细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率.结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建了二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到(16HBE)细胞株中,质粒/脂质体为1μg:2μl条件,能有效地转染细胞,转染效率达到50%以上.结论:成功构建siRNA真核表达载体并能成功体外转染,为下一步气道炎症性疾病的基因沉默研究奠定了良好的基础.
