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肺炎支原体肺炎患儿急性期和恢复期血浆H-ficolin和L-ficolin水平分析
目的 了解肺炎支原体肺炎患儿急性期和恢复期血浆中H-ficolin、L-ficolin水平的变化.方法 采用ELISA法检测85例肺炎支原体肺炎患儿急性期和恢复期血浆H-ficolin、L-ficolin水平,并进行相关性分析.结果 急性期H-ficolin水平1.8～25.2 μ g/ml,平均(11.9±5.9)μ g/ml,恢复期H-ficolin水平0.3～26.5 μ g/ml,平均(10.1±5.7)μ g/ml,急性期明显高于恢复期(Z=2.161,P=0.031).急性期L-ficolin水平0.2～10.6μ g/ml,平均(4.5±2.3)μ g/ml,恢复期L-ficolin水平0.03～ 10.2μg/ml,平均(4.6±2.2)μ g/ml,急性期和恢复期无统计学差异(t=0.245,P=0.807).患儿急性期血浆H-ficolin水平与L-ficolin水平明显相关(r=0.22,P=0.039).结论 H-ficolin可能参与儿童肺炎支原体肺炎疾病过程.
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人L-ficolin基因重组蛋白的表达及功能研究
目的:构建人L-ficolin基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达.方法:用PCR方法从质粒pCDNA3-L-ficolin中扩增L-ficolin cDNA片断,并将该片断插入pGEX-KG原核表达载体中,以进行插入基因的融合表达,表达后再用Thrombin切除GST以得到单纯的L-ficolin蛋白,SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,并以细菌侵袭试验检测所得蛋白的生物学活性.结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG-L-ficolin原核表达载体,并使之在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的分子质量(Mr)与预期值相一致.原核表达的L-ficolin蛋白具有调理吞噬作用,促进吞噬细胞吞噬细菌的能力, L-ficolin调理吞噬能力呈剂量依赖关系,并显著高于对照蛋白.结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-L-ficolin,经过Thrombin作用后得到的L-ficolin蛋白具有生物学活性,为进一步研究人L-ficolin的功能奠定了基础.
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L-ficolin(P35)与HCV和HBV感染的相关性
目的 探讨L-ficolin与丙型肝炎(丙肝)病毒( HCV)、乙型肝炎(乙肝)病毒( HBV)感染的相关性,为丙肝、乙肝的免疫治疗探索新的途径. 方法 采用ELISA检测103例丙肝、126例乙肝患者血清中的L-ficolin的含量,并与126例正常人血清中的L-ficolin含量进行比较. 同时,用荧光染料FITC(或PE)标记L-ficolin的抗体行流式细胞术( FCM)检测丙肝、乙肝患者外周血单个核细胞( PBMC)和DC细胞内L-ficolin的表达. 根据以上两个实验的结果将HCV的各个基因成分包括NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、E1、E2、Core及pblue-HBV的真核表达质粒,与L-ficolin构建在pGL2载体上的启动子共转染到HepG2细胞,48 h后收获细胞,用Luciferase荧光报告基因试剂盒检测细胞荧光,探讨是病毒的何种成分与L-ficolin表达相关. 结果 夹心ELISA法检测到丙肝患者血清中的L-ficolin表达水平明显高于正常人( P<0.05) ,而乙肝患者血清中的L-ficolin表达水平却比正常人低(P<0.05). FCM检测丙、乙肝患者的PBMC也得到同样的结果,且进一步发现L-ficolin可能主要表达在DC细胞中. 同时用HCV/HBV感染纯化的人DC细胞,可见HCV感染的DC细胞中的L-ficolin升高,而HBV感染的DC细胞中的L-ficolin降低,进一步验证上述的实验结果. 用Luciferase荧光报告基因试剂盒检测共转染病毒各种基因成分与L-ficolin启动子得到的荧光值表明,HCV全基因组以及部分基因如Core、NS4a、NS4b等能使L-ficolin启动子荧光表达上升,而HBV复制子则使L-ficolin启动子荧光表达下降. 免疫组化结果显示正常人肝组织表达L-ficolin蛋白,但是发生乙肝及丙肝感染癌变的组织中L-ficolin蛋白表达均下降甚至不表达. 结论L-ficolin在丙肝、乙肝患者体内表达异于正常人,提示L-ficolin在对抗HCV、HBV感染有一定作用. HCV能够激活L-ficolin的启动子,而HBV可能抑制L-ficolin启动子的激活. 同时肝组织是产生L-ficolin蛋白的场所,当肝组织癌变,则L-ficolin蛋白表达发生异常. 提示L-ficolin蛋白与肝组织癌变相关.
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L-ficolin保护小鼠抵御伤寒杆菌感染作用的研究
目的:探讨L-fcolin在小鼠体内抵御鼠伤寒杆菌(Salmonella typhiurium)感染的作用.方法:以构建的pcDNA3-L-ficolin、pcDNA3及生理盐水分别作为实验组、阴性对照组及空白对照组,用活体基因导入仪分别肌肉内注射于感染鼠伤寒杆菌C5的BALB/c小鼠,观察小鼠的生存时间,检测肝脾中的活菌数、肝脾脏器重量指数(WI)以及脾脏中IFN-γ和IL-4的水平.结果:于注射后第7天,检测3组小鼠的各项指标.实验组小鼠的半数死亡时间明显长于两个对照组.实验组肝、脾组织中的活菌数,分别为(5.12±0.21)log CFU/(mL·g)及(3.29±0.83)log CFU/(mL·g); 阴性对照组分别为(7.49±1.27)log CFU/(mL·g)及(6.46±0.56)log CFU/(mL·g); 空白对照组分别为(7.52±1.12)log CFU/(mL·g)及(6.44±0.27)log CFU/(mL·g); 实验组明显低于两个对照组(P＜0.05).实验组小鼠的脾WI为0.376±0.16,明显低于阴性对照组(为0.84±0.12)及空白对照组(为1.01±0.05,P＜0.05).实验组脾组织匀浆中IFN-γ的水平为(1287.87±194.96)ng/L,明显高于阴性对照组[为(464.19±68.72)ng/L],空白对照组[为(361.17±201.27)ng/L],(P＜0.05); 但3组小鼠脾脏组织匀浆中Th2型细胞因子IL-4的水平没有区别.结论:pcDNA3-L-ficolin对小鼠抵御伤寒杆菌的感染有一定的保护作用,其作用机制可能是通过提高TH1型细胞因子IFN-γ的水平而抑制细菌的生长.
