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酵母菌/遗传学文献资料
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Sedlin突变体S124A对其与PAM14相互作用的影响
目的 构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点.方法 用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S124)设计定点突变引物;以pAS-Sedlin为模板,以两条含有突变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用Dpn Ⅰ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感受态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序;将构建的定点突变质粒pAS-sedIins与pACT2-PAM14共转化至酵母Y190中,并对生长至合适大小的克隆进行B-半乳糖苷酶活性分析.结果 构建了pAS-Sedlin的定点突变质粒pAS-SedlinS,其与pACT2-PAM14共转克隆的β-半乳糖苷酶活性反应呈阳性,并且Sedlin S124A蛋白与PAM14蛋白的相互作用比野生型Sedlin蛋白与PAM14蛋白相互作用强.结论 成功构建了Sedlin S124A,Sedlin蛋白的S124并不是其与PAM14在酵母中相互作用的特异性结合位点.
