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片仔癀抑制淋巴管新生的作用及其机制研究
目的 研究片仔癀(PZH)体外对淋巴管新生的抑制作用及其机制. 方法 体外培养人淋巴内皮细胞(HLEC),分成对照组及PZH低、中、高剂量组,倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;TransweU观察细胞迁移;Tube Formation观察细胞管腔形成;Western Blot检测细胞促淋巴管新生相关因子蛋白表达. 结果 PZH低、中剂量组对HLEC的细胞形态、周期、凋亡无明显影响,而PZH高剂量组具有降低细胞密度、诱导HLEC凋亡、增加G0/G1期细胞比例和降低S期细胞比例的显著作用(P＜0.05);PZH可显著降低HLEC的迁移能力和管腔形成能力,且呈现一定的剂量依赖;PZH明显下调HLEC中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3/10的蛋白表达(P＜0.05). 结论 PZH体外对HLEC的淋巴管新生有显著抑制作用,通过抑制VEGFC、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3/10等表达是其抑制淋巴管新生的重要作用机制.
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黑素瘤细胞中诱导型一氧化氮合酶信号调控机制及其促淋巴内皮细胞增殖
目的 探讨B16黑素瘤细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)信号调控机制,以及该信号通路对淋巴内皮细胞(LEC)增殖的影响.方法 将B16细胞iNOS信号调控实验分为4组:空白对照组、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)处理组、VEGF-C +iNOS拮抗剂氨基胍(Ag)组、VEGF-C+VEGF受体-3(VEGFR-3)拮抗剂MAZ-51组.培养48 h后用实时定量聚合酶链反应、Western blot、硝酸还原酶法检测细胞中iNOS的mRNA、蛋白的表达水平及一氧化氮(NO)的生成量.LEC增殖实验中对小鼠LEC及B16细胞共培养,分为6组:A组(单纯LEC)、B组(LEC+ VEGF-C)、C组(LEC+B16)、D组(LEC+ B16+ VEGF-C)、E组(LEC+ B16+ VEGF-C+ Ag)、F组(LEC+ B16+ VEGF-C+MAZ-51).采用5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测LEC增殖.结果 iNOS信号调控实验中,VEGF-C组中B16细胞iNOS mRNA及蛋白的表达水平较空白对照组均显著提高(1.10±0.03比0.69±0.02,P=0.008),而加有Ag或MAZ-51组中iNOS mRNA及蛋白的表达水平不仅低于VEGF-C组(0.35±0.03比1.10±0.03,P=0.005;0.42 ±0.02比1.10 ±0.03,P=0.004),且低于空白对照组(0.35±0.03比0.69±0.02,P=0.028;0.42±0.02比0.69±0.02,P=0.025).对NO检测后发现VEGF-C组中NO的吸光度(A)值为0.25±0.03,明显高于空白对照组(0.19 ±0.03,P=0.008),且显著高于加有Ag(0.07 ±0.02,P=0.017)或MAZ-51 (0.07±0.02,P=0.015)组.对小鼠LEC增殖水平结果显示:各组增殖率分别为(0.45±0.02)％、(0.47±0.03)％、(0.48±0.05)％、(0.51±0.02)％、(0.24±0.01)％和(0.28±0.03)％,与空白对照组A组比较,B、C、D组中LEC的增殖水平均显著升高(P=0.029,P=0.024,P=0.009),而E、F组显著降低(P=0.006,P=0.005).结论 抑制B16细胞中VEGF-C/VEGFR-3信号通路能够减少iNOS的表达,从而进一步减少LEC的增殖.
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VEGF-C基因修饰的淋巴结移植促进淋巴内皮细胞再生的初步研究
目的 探讨采用VEGF-C基因修饰的淋巴结移植对移植淋巴结周围组织内淋巴内皮细胞再生的影响. 方法 取成年雄性SD大鼠36只,体重200.1～271.5 g,选取一侧采用带血管蒂淋巴结同侧原位移植方法制备腋窝淋巴结移植模型后,随机分为两组(n=18),分别将1.5×108 PFU带Flag标签的VEGF-C基因过表达腺病毒载体及空载腺病毒载体注射入实验组及对照组大鼠移植淋巴结中.术后3d,免疫荧光染色观察淋巴结内带Flag标签蛋白的表达情况;术后1、2、4周,免疫荧光染色观察移植淋巴结周围组织内Prox-1蛋白的表达并计算其荧光密度值；术后2、4周,通过测定患肢皮下注射偶氮蓝后大鼠血液在620 nm波长下吸光度(A)值,观察淋巴回流功能改善情况,以正常大鼠(正常组)及淋巴结移植大鼠(空白对照组)作为对照. 结果 术后3d实验组及对照组移植淋巴结内均可检测到带Flag标签蛋白的表达.术后l、2、4周,实验组移植淋巴结周围组织内Prox-1蛋白荧光密度值呈进行性增加,且均明显强于对照组(P＜0.05).正常组及空白对照组大鼠血液A值分别为0.539±0.020及0.151±0.007.术后2周实验组及对照组A值分别为0.170±0.011及0.168±0.010,4周时分别为0.212±0.016及0.197±0.006,均显著低于正常组(P＜0.05),但与空白组比较差异无统计学意义(P＞ 0.05)；实验组及对照组间比较,差异亦无统计学意义(P＞0.05). 结论 VEGF-C基因修饰的淋巴结移植能显著促进移植淋巴结周围组织内淋巴内皮细胞的再生,但在4周内不能改善大鼠患肢淋巴回流功能.
