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结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究
目的 将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究.方法 采用PCR方法 从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠.将各目的 片段克隆至pMD18-T载体中进行测序.将测序正确的目的 基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α.经IPTG 诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定.通过镍柱对融合蛋白进行纯化.在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定.结果 PCR法扩增获得的各目的 基因片段与GenBank报道的一致.构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE 分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达.融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应.该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应.结论 结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础.
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mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达
目的 在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和faA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-F1aA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blotting进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达.结论 嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础.
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HIV-1/2/O 抗体联合诊断试剂盒的制备及其检测效果的研究
目的 制备HIV-1/2/O抗体检测试剂盒并评估其检测效果.方法 采用RT-PCR分别获取HIV-1型M、O组的gp41以及HIV-2 gp36的优势表位基因,并通过柔性链将各表位基因嵌合,重组表达,亲和纯化、辣根过氧化酶标记,与包被抗原配对筛选,获取检测HIV 抗体的双抗原试剂.结果 成功嵌合各表位基因并获得表达,纯化后的抗原具有很高的抗原活性,检测灵敏度与国外试剂相当.结论 采用柔性链技术嵌合表达制备的HIV-1/2/O 抗体联合诊断试剂盒对HIV O组病毒株的检测具有较高灵敏度.
