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华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达
目的构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因重组质粒,分析其编码序列,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定. 方法根据RPEF基因已知序列设计一对引物,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段;将目的基因PCR产物和空质粒pGEX-4T-1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL21.将构建的重组质粒pGEX-4T-1-RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western-blot方法鉴定其原核表达效果. 结果成功构建出RPEF基因原核重组质粒pGEX-4T-1-RPEF.SDS-PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL21系统中得以高效表达,其融合蛋白分子量大约45kD,与理论值相符.Western-blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别,融合蛋白具有GST免疫反应性.结论筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因,并成功构建原核表达载体及在E.coliBL21系统中高效表达.
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华支睾吸虫RPEF基因的克隆与序列分析
目的构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因PET重组质粒,分析其编码序列.方法根据RPEF基因已知序列设计一对引物,用PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段;将目的基因PCR产物和空质粒PET30a(+)同时用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶双酶切,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL21.将构建的重组质粒PET30a(+)-RPEF经双酶切、PCR、测序鉴定后证明获得正确的重组克隆.结果成功构建出RPEF基因原核重组质粒PET30a(+)-RPEF.序列分析表明,RPEF蛋白与鼠类RNApolymerase Ⅱ延长因子具有很高的同源性.结论RPEF基因在华支睾吸虫基因表达调控机制中可能起重要作用.RPEF基因重组表达载体PET30a(+)-RPEF的成功构建可为更深入地分析其基因功能、肝吸虫病药物靶标的筛选奠定基础.
