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丝素-壳聚糖复合制作的三维可降解多孔支架
背景:单独使用天然材料如胶原、明胶及纤维蛋白制备的支架虽然解决了生物相容性等问题,但由于其降解太快,在作为细胞支架时往往提前塌陷而达不到诱生新组织的目的.目的:探讨应用丝素与壳聚糖复合制作生物可降解三维多孔的支架,并对其特性进行检测.设计、时间及地点:材料学观察实验,于2008-06/2009-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成.材料:春蚕茧由浙江省海宁市马桥镇黄墩庙村蚕农赠送,壳聚糖为上海伯奧生物科技有限公司产品.方法:通过脱胶、溶解、透析这3个主要步骤制成质量浓度为15 g/L的丝素溶液,将壳聚糖溶解在2%的醋酸溶液中制成25g/L.的壳聚糖-乙酸溶液,然后将两者混合,配制成丝素/壳聚糖质量比分别为10:0,5:5,4:6,3:7,2:8,0:10的6种溶液,分别吸入24孔板中,4℃排出气泡后,-20℃预冷冻12 h,再冷冻干燥30 h.取出后梯度乙醇水化,再用NaOH-乙醇溶液中和稳定1h,漂洗后再次冻干.主要观察指标:光镜和扫描电镜观察各种质量比配制的支架孔径、结构;采用改良的液体替代法测定各种支架的孔隙率;测定各种支架在体外4周的降解率.结果:丝素/壳聚糖质量比为10:0制成的支架孔隙粗大,非常蓬松,易碎,溶失率太高;相反仅以壳聚糖制成的支架冻干后较硬,缺乏足够的弹性;以5:5,4:6,3:7,2:8制成的复合支架冻干后,支架较松软,类似海绵,随着壳聚糖浓度增加,支架硬度增加,支架上有分布均匀且细密的小孔.光镜下各个孔形态不规则,每个孔紧密相连并联通,孔径大小均匀,孔径20~100 μm,随着壳聚糖浓度增加,孔径逐渐减小.支架孔隙率测定结果显示,丝素/壳聚糖质量比为4:6组>5:5组>3:7组>2:8组,与丝素/壳聚糖质量比为2:8组比较,5:5组和4:6组的支架孔隙率均明显增大(P<0.05).各种质量配比制成的丝素-壳聚糖复合支架吸水膨胀率无明显差异(P>0.05).第4周时丝素/壳聚糖质量比为2:8组降解慢,5:5组降解快.结论:在理化性能方面,将丝素与壳聚糖混合制作的复合支架较单纯用丝素或壳聚糖制作的支架均显示出明显优势,其中用丝素/壳聚糖质量比为5:5及4:6制成的复合支架符合软骨组织工程的需要.
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骨组织工程三维复合支架修复兔桡骨骨缺损
背景：前期实验构建的丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架具有良好的理化性质。
目的：观察丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维复合支架修复兔桡骨大段骨缺损的效果。
方法：取新西兰大白兔36只，建立右侧桡骨长段骨缺损模型，随机均分为3组，实验组于骨缺损处植入丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架，对照组于骨缺损处植入丝素/壳聚糖复合支架，空白对照组造模后不作任何处理。术后4，8，12，16周进行X射线摄片、标本大体观察、组织病理学观察。
结果与结论：术后16周，实验组缺损区X射线影像与正常骨组织无区别，骨髓腔完全再通，有明显的骨组织生成，苏木精-伊红染色可见骨小梁和较多核深染的长梭形骨细胞；对照组X射线骨密度影略低于正常骨组织，部分骨髓腔再通，苏木精-伊红染色可见骨细胞周围有不少软骨细胞，未见明显的骨小梁或骨板结构，排列较紊乱；空白对照组断端骨钙化影同正常骨组织一致，断端各自封闭形成骨不连，苏木精-伊红染色可见较多的纤维组织和少量的类骨组织。表明丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石三维复合支架可较好地修复兔桡骨大段骨缺损。 -
壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥的理化特性
背景：脊柱成形和脊柱后凸成形治疗中采用的硫酸钙骨水泥理化性质好，对人体无毒性作用，同时具有降解性能，但单独使用降解较快。
目的：研制具有载药缓释功能的壳聚糖微球丝素基硫酸钙骨水泥。
方法：采用三聚磷酸钠乳化交联法制备壳聚糖微球。采用浓度分别为3%，6%，9%的丝素溶液与CaSO4?0.5H 2 O混合，通过万能力学试验机确定骨水泥力学性能佳时的丝素浓度，在此浓度下，按壳聚糖微球占CaSO 4?0.5H 2 O的质量比分别为0.5%，1%，5%的比例制备壳聚糖微球丝素基硫酸钙骨水泥，测定其抗压强度，并通过X射线多晶衍射仪及傅里叶红外光谱明确达到佳抗压强度组的骨水泥成分，电镜观察复合骨水泥中壳聚糖微球的形态。
结果与结论：当丝素溶液浓度为6%，壳聚糖微球含量为0.5%时，复合骨水泥的抗压强度大，为(39.17±1.96) MPa，此时复合骨水泥的初凝时间为(12.99±1.63) min，终凝时间为(21.55±0.54) min；骨水泥中主要晶相组成为硫酸钙，傅里叶红外光谱结果证实复合骨水泥中含有丝素及壳聚糖；复合骨水泥中的微球表面稍有皱缩，但球形仍然完整，未见明显破坏，可见在制备复合骨水泥的过程中微球能保持稳定而不被破坏。 -
N-乙酰半胱氨酸丝素微球复合磷酸钙骨水泥的制备及表征
背景：磷酸钙骨水泥因其良好的生物相容性及骨传导性已被用于临床，但因其力学性能较差以及骨诱导性的欠缺限制了其广泛应用。
目的：制备复合N-乙酰半胱氨酸丝素微球的注射性磷酸钙骨水泥，构建一种具有药物缓释功能的新型注射性植骨材料，并评价其理化性能及细胞相容性。
方法：采用乳化溶剂蒸发法制备空丝素微球，用丝素微球吸附不同浓度N-乙酰半胱氨酸溶液，确定大理论载药率时N-乙酰半胱氨酸浓度，再将载有N-乙酰半胱氨酸的丝素微球载入磷酸钙骨水泥中，检测负载N-乙酰半胱氨酸丝素微球的磷酸钙骨水泥的体外释药性能；体外将小鼠MC3T3-E1成骨细胞与N-乙酰半胱氨酸丝素微球磷酸钙骨水泥共培养，扫描电镜观察细胞在材料表面的贴附及生长。将单纯磷酸钙、丝素微球磷酸钙、N-乙酰半胱氨酸丝素微球磷酸钙骨水泥共3种骨水泥浸提液，以及含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-MEM培养基，与MC3T3-E1细胞共培养，对照组仅用上述培养基培养，采用MTS法评估各组细胞增殖情况。
结果与结论：①复合骨水泥中的微球表面光滑平整，大小基本均一，散在分布，球体未见明显破坏，可见在制备复合骨水泥的过程中微球能保持稳定，不被破坏；②采用丝素微球、磷酸钙骨水泥作为药物双重缓释体系在前24 h累计释药百分比较对照组明显减少(P <0.05)，后续28 d中N-乙酰半胱氨酸丝素微球磷酸钙骨水泥组释药速度也较单纯磷酸钙骨水泥显著降低(P <0.05)；③实验中各组材料浸提液对MC3T3-E1细胞的生长均无明显影响，无明显细胞毒性；④结果说明：N-乙酰半胱氨酸丝素微球复合磷酸钙骨水泥材料具备良好的细胞相容性，有望为骨修复生物材料的研究提供参考。 -
担载神经生长因子(NGF)的乳液法涂层纤维体外缓释研究
目的:目前周围神经修复中,神经导管是研究热点,本文研究乳液法涂层纤维制备的神经导管在神经修复中应用的可能性.方法:本文采用乳液法制备担载NGF的丝素-聚乳酸(PLLA)涂层电纺纤维,观察纤维的形态,测定NGF的体外释放动力学参数,并考察纤维释放液对于PC12细胞增殖的影响.结果:担载NGF的涂层纤维具备类似于细胞外基质(ECM)的三维结构和多孔形态;涂层纤维中NGF体外有效缓释10天;细胞实验中,在含有释放液的培养基中生长的PC12细胞,与空白对照组相比,荧光强度平均多了2000-4000个荧光强度,所以释放液可以更好地促进PC12细胞的增殖.结论:担载NGF的乳液法涂层纺丝纤维具备促进缺损周围神经修复的条件,可以进一步研究在动物体内修复缺损周围神经中的效果,为以后的临床应用打下基础.
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取向性生物导电型材料的制备及对神经再生的影响
目的:通过不同方法研制出取向性静电纺丝复合材料,确定材料与神经再生之间的构效关系,为理想的神经再生植入装置的设计提供扎实的理论基础,为周围神经缺损的修复提供更有效的方法.方法:本实验通过切片法结合静电纺丝及3D打印等技术制备具有取向性的丝素(silk fibroin,SF)/石墨烯(Graphene,Gr)复合材料.显微镜观察材料表面结构形貌.电化学分析提供复合材料的电活性表征.细胞共培养观察该复合材料对神经细胞的影响.结果:不同方法制备的不同取向性复合材料具有不同的导电性,其中3D打印生成取向性的静电纺丝复合材料具有良好的导电性,并且通过体外细胞实验表明其支持培养的施万细胞的存活和生长,揭示其具有良好的生物相容性.结论:结果均表明3D打印取向性复合材料结合了优秀的导电性能与良好的生物相容性等性质,很好地模拟了神经发育的天然神经细胞微环境.
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丝素纤维与背根神经节体外生物相容性初步研究
目的:通过丝素纤维与背根神经节共培养观察其与神经组织的相容性.方法:采用丝素制备,背根神经节与丝素共培养,免疫细胞化学等方法.结果:培养7天后大量的细胞从背根神经节爬出,缠绕在丝素材料上.经免疫细胞化学染色激光共聚焦显微镜观察,示该类细胞主要为雪旺细胞.另可见大量的神经纤维从背根神经节发出,沿着丝素材料延伸.结论:丝素与背根神经节有良好的组织相容性,可适用于外周神经修复.
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丝素/β-TCP三层一体化高仿生支架生物安全性的初步评价
目的 初步评价丝素/β-磷酸三钙(β-TCP)三层一体化高仿生支架的生物安全性.方法 以丝素蛋白和β-TCP为支架材料,采用改进的共混/冷冻干燥法制作三层一体化高仿生支架.对该支架行急性毒性试验、亚急性毒性试验、血液相容性试验、CCK-8试验和组织学观察等方法,评价其生物安全性.结果 急性与亚急性毒性试验后,动物一般情况良好,2周后体重、血常规等未见明显变化,心、肝、肾等重要器官无异常改变.支架溶血率为2.09％,符合医用材料对溶血试验的要求.CCK-8试验证明支架对软骨细胞无毒性.软骨细胞支架复合组织块行番红、阿利辛蓝染色可观察到细胞在软骨部分中黏附良好,分布均匀,细胞外基质分泌较多.结论 丝素/β-TCP三层一体化高仿生支架具有良好的生物安全性.
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脂肪干细胞复合多孔丝素材料修复兔尿道缺损
目的 探索脂肪间充质干细胞(ADMSCs)复合多孔丝素膜(PSFS)对尿道缺损的修复效果.方法 建立雄性新西兰大白兔尿道缺损模型后分为3组,每组13只.A组用PSFS修补,B组用BrdU标记ADMSCs复合PSFS修补,C组为尿道缺损对照.手术前后行尿道造影.术后2、4、6周取修复段尿道行组织学检查,免疫组织化学染色检测BrdU标记ADMSCs、广谱角蛋白阳性细胞及巨噬细胞情况.结果 术后C组尿道狭窄和尿屡的并发症总发生率为76.92% ,高于A组的23.07% 和B组的15.38% (P<0.05).组织学观察C组的血管、上皮细胞层、平滑肌重建少;A、B组重建多、B组多于A组.BrdU标记ADMSCs在3时间点缺损区丝素膜中散在可见;广谱角蛋白染色C组缺乏尿道上皮的复层柱状上皮形态,无乳突状黏膜存在;A、B组与正常尿道黏膜相似,有较多乳突状结构;术后4周巨噬细胞表达B组比A组少[(11.66±1.58)/HP vs.(13.88±2.08)/HP](P<0.05).结论 ADMSCs复合PSFS具有促进尿道缺损修复的作用.
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丝素空白微球的制备
目的 以丝素蛋白为载体,制备丝素空白微球,并对影响微球粒径的因素进行考察.方法 以液状石蜡为油相,再生丝素溶液为水相,Span 80为乳化剂,戊二醛为交联剂,采用乳化-化学交联法制备丝素微球,采用显微镜测定法测定微球的平均粒径,采用单因素试验考察了Span 80、转速、戊二醛、水油比对微球平均粒径的影响.结果 所制得的微球圆整,无粘连.结论 以丝素为载体,采用乳化-化学交联法,制备了丝素空白微球.
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明胶、丝素-壳聚糖微载体培养肝细胞的比较研究
目的 自制丝素-壳聚糖多孔微载体,在模拟微重力条件下接种培养肝细胞,并与多孔微载体Cultispher S上的细胞生长状况进行比较.方法 油包水乳化后以冻干法制作丝素-壳聚糖多孔微载体.培养体积50 ml,以旋转培养系统分别对接种至丝素-壳聚糖多孔微载体和Cultispher S的CL-1细胞进行培养,并动态观察形态学、细胞计数,检测人源性白蛋白分泌和尿素合成功能.结果 CL-1细胞在Cultispher S上呈单层生长,在丝素-壳聚糖多孔微载体上呈现多层生长.第9天细胞计数结果达到峰值,丝素-壳聚糖多孔微载体的细胞密度可达到5.7×106个/ml,明显高于Cultispher S组(P<0.01).自培养第10天起,丝素-壳聚糖多孔微载体组上清中的人源性白蛋白和尿素水平均明显高于Cultispher S组(P<0.01).结论 相对Cultispher S,丝素-壳聚糖多孔微载体更适合在微重力条件下培养CL-1细胞.
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壳聚糖-丝素支架材料的细胞毒性检测
目的:对壳聚糖素(chitosan-silk fibroin)共混多孔支架体外进行细胞毒性实验,探讨壳聚糖-丝素支架对骨髓问充质干细胞的细胞毒性作用情况,为该材料临床应用提供依据.方法:制备壳聚糖-丝索共混多孔支架,并制备该支架材料的浸提液.通过MTT法检测25%、500%、100%浓度的壳聚糖一丝素浸提液对兔骨髓间充质干细胞(JBMSCs)的细胞毒性作用,以第1,3,5,7天为检测时间点.观察细胞生长状况,计算细胞相对增殖率.并对材料的细胞毒性进行分级.以正常培养基为阴性对照组,含0.64%苯酚的培养液为阳性对照组.结果:BMSCs在不同浓度实验组及阴性对照组中生长均好.细胞呈长梭形等形态,细胞形态饱满有光泽,MTT法结果表明同一时间点各浓度实验组与阴性对照组问之间差异均无统计学意义(P>0.05),各时间点各浓度浸提液对BMSCs细胞的相对增殖率均在95%以上,毒性分级为0级或1级,基本上无毒性.结论:壳聚糖一丝素多孔支架材料细胞相容性良好,基本上无细胞毒性,符合生物材料细胞毒性试验的安全标准,是一种很有潜力的组织工程支架材料.
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壳聚糖-丝素复合材料的降解性测定
目的:观察壳聚糖-丝素复合支架材料的体内外降解性能.方法:①体外降解实验:冻干法制备壳聚糖-丝素复合多孔支架材料,将制备好的壳聚糖-丝素复合材料置于37℃恒温的PBS、1.5 mg/ml溶菌酶溶液中进行体外降解实验.定期测定壳聚糖-丝素复合材料的降解百分率,并观察材料降解的形貌变化及液体变化情况.②体内降解实验:将壳聚糖-丝素复合材料埋植于ICR小鼠脊柱两侧皮下,定期取出,测定壳聚糖-丝素复合材料的降解百分率,并观察试件周围组织反应情况.了解壳聚糖-丝素复合材料在体内外的降解性,以及组织相容性的初步情况.结果:壳聚糖-丝素复合材料在体外PBS中能较稳定地降解,8周降解百分率为67%,溶荫酶对复合支架的降解具有明显的促进作用.壳聚糖-丝素复合材料体内8周降解百分率为73%,降解趋势相似于体外,体内降解速率快于体外PBS组,但慢于溶菌酶组.埋植材料周围皮下组织无充血、水肿、化脓等现象,无组织坏死发生,植入早期局部组织有轻度的炎症反应,后较快消退.表明支架材料对小鼠基本上无毒害.结论:壳聚糖-丝素复合多孔支架材料具有良好的降解性与组织相容性,是一种很有潜力的组织工程支架材料.
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丝素固定化凝血酶的工艺研究
目的：：考察家蚕丝素对凝血酶的固定化作用。方法：以家蚕丝素为载体,戊二醛为交联剂制备固定化凝血酶。以固定化凝血酶的活力回收率( AR)为考察指标,采用正交试验确定丝素固定化凝血酶的佳工艺条件。结果：丝素固定化凝血酶的佳工艺条件为：固定时间为6 h,加酶量为2400 NIH·g-1载体,温度为25℃,pH为7.6。固定化凝血酶的回收率( AR)达67.22%。结论：丝素对凝血酶有良好的固定化作用。
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丝素降高血糖小白鼠的效果观察
将高血糖小白鼠作为本次试验的动物,测定丝素溶液、丝素粉的降血糖效果.使用等量的丝素溶液、丝素粉和一些降血糖药剂,给高血糖小白鼠在餐后喂服,然后连续4周测量小白鼠的血糖值,发现分别下降了14.12%、16.31%、18.36%.丝素对降血糖有明显的效果.因此,可以将蚕丝资源进行综合利用,将其开发为人体降血糖的保健食品,而本次的试验可以为其提供试验数据.
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PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架材料的制备及细胞相容性研究
目的 探讨PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架的制备方法 及细胞相容性. 方法 采用静电纺丝法制备PLGA-丝素.胶原(实验组)及单纯PLGA(对照组)纳米三维多孔支架,扫描电镜观察两组支架材料,测定支架纤维直径、孔隙率、吸水率及抗拉强度.取8只SD近交系乳鼠双侧臂丛神经及坐骨神经,分离培养SC,S-100免疫组织学观察并测定SC纯度.取第4代SC以5 × 104个/mL分别与25%、50%及100%浓度的两组支架浸提液进行培养,以DMEM培养作空白对照组.培养1、3、5、7 d采用MTT法测定吸光度(A)值.将第4代SC以5×104个/mL密度分别接种至PLGA-丝素-胶原(实验组)和单纯PLGA(对照组)纳米三维多孔支架支架复合培养.复合培养2、4、6 d行扫描电镜观察,另于4 d行激光扫描共聚焦显微镜观察SC在材料上生长情况. 结果 扫描电镜观察显示两组支架呈相互交联的多孔网状无纺结构.实验组和对照组纤维直径分别为(141±9)um和(205 ±11)nm;支架内孔洞相互连通,孔隙率分别为87.4%±1.1%和85.3%±1.3%;吸水率分别为2 647%±172%和2 593%±161%;抗拉强度分别为(0.32 ±0.03)MPa和(0.28 ±0.04)MPa;两组比较差异均有统计学意义(P<0.05).S-100免疫组织化学染色显示SC纯度为96.5%±1.3%.MTT检测SC在不同浓度实验组及空白对照组中生长良好,A值均随时间延长而增大,同组各时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05);各时间点各浓度实验组及空白对照组间比较,差异无统计学意义(P>0.05).扫描电镜观察显示,实验组SC在支架上生长良好,4 d轴突连接,6 d后大量增殖,基质分泌;生长情况优于对照组.复合培养4 d激光扫描共聚焦显微镜观察结果 与扫描电镜一致. 结论 采用静电纺丝方法 制备的PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架安全无毒,具备合适的孔径和孔隙率,适合SC生长,细胞相容性良好,是一种组织工程神经良好的支架载体.
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组织工程角膜支架材料再生丝素膜的生物相容性
目的:研究再生丝素膜作为组织工程角膜支架材料的可行性.方法:制备再生丝素膜,测定其接触角与透光率;在材料上接种兔角膜上皮细胞,观察细胞生长情况,MTT法测定6h贴壁率;将膜材料植入兔角膜基质层间,观察材料的透明性、可降解性及生物反应性.结果:再生丝素膜材料接触角为58.2度;492nm波长透光率为93.0%,570nm波长透光率为94.4%;细胞在材料表面贴附良好,6h贴壁率为31.6%,经统计学比较优于普通培养板;4wk时材料开始变得不透明,从角膜缘长入新生血管,8wk时新生血管达到高峰,12wk时材料部分降解,至16wk材料大部分降解,新生血管显著减少.结论:再生丝素膜具有较好的生物相容性.
