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GST-hPlk2融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
目的 构建GST-hPlk2融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hPlk2基因全长,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hPlk2,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果 酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒GST-hPlk2,并用Western blot方法证实了GST-hPlk2融合蛋白的表达.结论 成功构建了GST-hPlk2原核表达载体,并证实了其在原核细胞E coli中的表达,为进一步纯化Plk2及研究其结构与功能提供了前提基础.
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骨肉瘤MG-63细胞中Polo样激酶2的表达和定位
目的:构建真核表达载体3* Flag-hPlk2并检测其在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以GSThPlk2为模板,利用PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其克隆至含有3* Flag标签的真核表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察3* Flag-hPlk2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀法纯化hPlk2蛋白.结果:hPlk2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体3* Flag中,Western blot检测到3*Flag-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为80kDa.3*Flag-hPlk2在骨肉瘤MG-63细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hPlk2蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hPlk2真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPlk2融合蛋白的表达,并纯化hPlk2蛋白.3 * Flag-hPlk2蛋白主要定位在细胞质和核周.
关键词： hPlk2 Western blot 免疫沉淀
