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沉默PTX3表达对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨沉默正五聚蛋白3(PTX3)表达对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响.方法 采用qRT-PCR法和Western blotting法检测子宫内膜癌JEC、HEC-1B、KLE、Ishikawa细胞及子宫内膜上皮HEECs细胞PTX3 mRNA和蛋白表达,筛选PTX3表达高的子宫内膜癌细胞进行后续实验.取传3代、对数生长期子宫内膜癌细胞,随机分为siRNA-PTX3组和siRNA-NC组,按Lipofectamine TM 2000说明分别转染siRNA-PTX3、siRNA-NC.收集两组转染24 h细胞,采用CCK-8法检测再培养24、48、72、96 h细胞增殖活性,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,采用流式细胞术检测细胞周期分布,采用Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力.结果 各子宫内膜癌细胞PTX mRNA和蛋白相对表达量均明显高于子宫内膜上皮HEECs细胞(P均<0.05),且以Ishikawa细胞PTX mRNA和蛋白相对表达量高.siRNA-PTX3组再培养48、72、96 h细胞增殖活性均低于siRNA-NC组同期(P均<0.05);与siRNA-NC组比较,siRNA-PTX3组细胞凋亡率明显升高,并且其G0/G1期细胞比例明显升高,S期细胞比例明显降低(P<0.05或<0.01).siRNA-PTX3组细胞侵袭和迁移能力均明显低于siRNA-NC组(P均<0.01).结论 沉默PTX3表达能够抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移,并诱导其凋亡.
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LV3-KiSS1-miRNA 的构建及其在体内外沉默效应观察
目的：构建靶向KiSS1基因的miRNA慢病毒质粒（LV3-KiSS1-miRNA），并观察其在人胚肾293T细胞及SD大鼠体内的沉默效应。方法利用四质粒系统合成LV3-KiSS1-miRNA，分别用LV3-KiSS1-miRNA （观察组）、LV3-N-miRNA （对照病毒组）、细胞培养液（空白对照组）与 KiSS1的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-KiSS1共转染293T细胞，72 h后采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（ GFP）阳性表达率，RT-PCR法检测细胞中的KiSS1 mRNA。将90只21日龄SD大鼠随机分为3组各30只，分别侧脑室注射LV3-KiSS1-miRNA（干扰病毒组）、LV3-N-miRNA （对照病毒组）和生理盐水（生理盐水组）40μL，采用RT-PCT法检测30、35、45日龄时大鼠下丘脑组织中的KiSS1 mRNA。结果空白对照组中无GFP表达，而观察组与对照病毒组的GFP表达率分别为89．4％、94．2％。观察组与对照病毒组、空白对照组比较KiSS1 mRNA表达量减少（P均＜0．01），沉默效率达到86％；对照病毒组与空白对照组比较，P＞0．05。干扰病毒组大鼠各日龄时下丘脑组织中KiSS1 mRNA表达水平明显低于生理盐水组和对照病毒组（P均＜0．05）。结论成功构建LV3-KiSS1-miRNA，并能高效、稳定地抑制293T细胞及SD大鼠下丘脑组织中KiSS1 miRNA的表达。
