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上皮性卵巢癌患者外周血及癌组织中KISS1 mRNA的表达及其临床意义
目的:探讨上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)患者外周血、癌组织中KISS1 mRNA的表达及其临床意义.方法:RT-PCR检测40例EOC、20例交界性卵巢肿瘤、20例良性卵巢肿瘤以及20例正常卵巢的组织及其术前静脉血中KISS1 mRNA的表达,分析KISS1 mRNA在4种组织间的表达差异性及在卵巢癌中的表达与临床病理特征的关系.结果:EOC组织及外周血KISS1 mRNA的表达量均高于良性肿瘤以及正常对照,差异有统计学意义(P ＜0.001);EOC组织及外周血KISS1 mRNA的表达量与组织分化、临床分期、有无转移、术后残留病灶大小有关(P＜0.05);KISS1 mRNA在EOC原发病灶中的表达量高于其在对应转移灶中的表达,差异有统计学意义(P =0.001);外周血与卵巢组织中KISS1 mRNA的表达水平呈正相关关系(r =0.669,P＜0.001).结论:KISS1基因可能参与了EOC的发生与发展,外周血KISS1 mRNA可作为卵巢癌分化程度、分期、复发及转移的生物学标志.
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外周血KISS1 mRNA对上皮性卵巢癌的诊断价值
目的:通过与CA125比较,探讨外周血KISS1 mRNA在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中的诊断价值.方法:采集2010年1月至2014年1月在南通大学第二附属医院住院拟手术的EOC患者40例手术前一天的外周静脉血和正常健康者静脉血,用RT-PCR法和电化学发光法分别检测外周血KISS1 mRNA和CA125的表达.结果:EOC早期组(Ⅰ～Ⅱ期)、晚期组(Ⅲ～Ⅳ期)KISS1 mRNA的表达量均显著高于正常健康者(均P＜0.01),而早期与晚期EOC组间比较无显著差异(P ＞0.05);EOC晚期组CA125的表达量明显高于早期组及正常健康者(均P＜0.01),而早期组与正常健康者比较无显著差异(P＞0.05).KISS1 mRNA ROC(receptive operator character curve,ROC)曲线的切值(cutoff)设为0.51、0.72时,阳性预测值(positive predictive value,PPV)分别为0.58和1,阴性预测值(negative predictive value,NPV)分别为0.92和0.7;CA125的cutoff值设为20、100 U/ml时,PPV分别为0.72和1,NPV分别为0.87和0.81.KISS1 mRNA、CA125对EOC均具有中度诊断效能(P=0.34);两者比较,KISS1 mRNA对早期EOC具有较高诊断价值(P=0.018),而CA125对晚期EOC的诊断价值较高(P＜0.01).结论:患者外周血KISS1 mRNA与CA125对EOC具有同等的诊断价值,KISS1 mRNA可作为EOC的一个新的肿瘤标志物;两者的联合检测可提高EOC的诊断效能,特别是早期EOC的诊断率.
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5-杂氮-2’-脱氧胞苷对人结直肠癌HCT116细胞KISS1基因表达及侵袭迁移的影响
目的:应用甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)干预人结直肠癌HCT116细胞,分析KISS1基因启动子甲基化与KISS1表达的关系及对细胞生物学特性的影响.方法:分别采用甲基化特异性-PCR、实时荧光定量-PCR和蛋白质印迹法检测不同剂量的5-Aza-dC干预不同时间后HCT116细胞中KISS1基因启动子的甲基化状态、mRNA和蛋白表达的影响;并应用Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力的变化,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞增殖能力的变化.结果:5-Aza-dC干预后,HCT116细胞KISS1基因启动子甲基化转为阴性.5-Aza-dC干预5d后,各个浓度处理组KISS1 mRNA及蛋白的表达量均较对照组有明显增高(P＜0.05),且随着浓度的增加,mRNA和蛋白的表达量逐渐上调,但5μmo1/L组与10 μmol/L组之间,差异无统计学意义(P＞0.05);干预后各组细胞的侵袭和迁移能力也较对照组明显下降(P＜0.05).结论:DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC能够逆转KISS1基因启动子的甲基化,并通过上调KISS1基因表达抑制结直肠癌HCT116细胞的侵袭和迁移能力.
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KISS1基因激活ERK1/2磷酸化通路抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的研究
目的:探讨KISS1及其受体基因KISS1-R在ERK1/2磷酸化通路中调节鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的分子机制.方法:采用实时荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹技术,检测KISS1、KISS1-R基因、黏着斑激酶(FAK)的表达;验证ERK1/2信号通路的磷酸化激活,EZR蛋白的表达与鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的关系.构建过表达KISS1及KISS1-R基因载体,通过划痕实验及Transwell实验分析过表达KISS1(SUNE-KISS1)及KISS1-R(SUNE-1R)基因对SUNE-1-5-8F鼻咽癌细胞系的迁移能力的影响.通过蛋白免疫印迹技术,检测在过表达KISS1及KISS1-R基因后,磷酸化FAK(p-FAK)和磷酸化ERK(p-ERK)以及EZR蛋白的表达水平.通过阻断ERK1/2通路的磷酸化激活,验证KISS1及KISS1-R基因对鼻咽癌细胞迁移能力的影响,以及对细胞转移相关蛋白p-FAK、EZR表达量的影响.后,通过siRNA抑制KISS1基因表达,进一步验证KISS1基因对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的调控作用.结果:实时荧光定量PCR实验发现,KISS1基因在SUNE-1-6-10B细胞中表达量相对于SUNE-1-5-8F细胞中较高.蛋白免疫印迹分析发现,KISS1及KISS1-R的蛋白表达量,以及p-FAK的表达量与鼻咽癌细胞转移能力呈负相关;EZR与鼻咽癌细胞转移能力呈正相关关系.划痕及Transwell实验分析发现,过表达KISS1及KISS1-R基因均能够有效抑制SUNE-1-5-8F细胞的迁移和侵袭能力.蛋白免疫印迹分析发现,过表达KISS1及KISS1-R基因能增加p-FAK及p-ERK1/2的蛋白表达量,抑制EZR蛋白的表达.加入ERK1/2通路特异性的阻断剂PD98059后,由过表达KISS1及KISS1-R基因引起的细胞迁移和侵袭的抑制状态被阻断.同时,由过表达KISS1及KISS1-R引起的p-FAK与p-ERK1/2的上调,EZR的下调均被恢复.通过siRNA的干扰,抑制了KISS1基因表达,从而引起SUNE-1-5-8F细胞的迁移和侵袭能力的增加.结论:过表达KISS1基因可以显著抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力;同时,通过siRNA干扰KISS1基因的表达,能够增加鼻咽癌细胞的迁移能力.KISS1及KISS1-R基因通过磷酸化激活ERK1/2通路,进一步激活p-FAK并抑制EZR表达,从而抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力.
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LV3-KiSS1-miRNA 的构建及其在体内外沉默效应观察
目的：构建靶向KiSS1基因的miRNA慢病毒质粒（LV3-KiSS1-miRNA），并观察其在人胚肾293T细胞及SD大鼠体内的沉默效应。方法利用四质粒系统合成LV3-KiSS1-miRNA，分别用LV3-KiSS1-miRNA （观察组）、LV3-N-miRNA （对照病毒组）、细胞培养液（空白对照组）与 KiSS1的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-KiSS1共转染293T细胞，72 h后采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（ GFP）阳性表达率，RT-PCR法检测细胞中的KiSS1 mRNA。将90只21日龄SD大鼠随机分为3组各30只，分别侧脑室注射LV3-KiSS1-miRNA（干扰病毒组）、LV3-N-miRNA （对照病毒组）和生理盐水（生理盐水组）40μL，采用RT-PCT法检测30、35、45日龄时大鼠下丘脑组织中的KiSS1 mRNA。结果空白对照组中无GFP表达，而观察组与对照病毒组的GFP表达率分别为89．4％、94．2％。观察组与对照病毒组、空白对照组比较KiSS1 mRNA表达量减少（P均＜0．01），沉默效率达到86％；对照病毒组与空白对照组比较，P＞0．05。干扰病毒组大鼠各日龄时下丘脑组织中KiSS1 mRNA表达水平明显低于生理盐水组和对照病毒组（P均＜0．05）。结论成功构建LV3-KiSS1-miRNA，并能高效、稳定地抑制293T细胞及SD大鼠下丘脑组织中KiSS1 miRNA的表达。
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中枢性性早熟相关致病基因的研究进展
中枢性性早熟是一种儿童性发育异常性疾病,突出的病理生理改变是下丘脑-垂体-性腺轴提前激活导致促性腺激素释放激素提前大量释放.基因、营养、环境等因素均在调控青春期发育中起着重要作用,其中基因突变是中枢性性早熟发病的关键因素.近的临床研究发现,kisspeptin及其受体基因的功能获得性突变以及ma-korin环指蛋白3基因的功能丧失性突变是中枢性性早熟的重要致病因素.
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雌性Sprague-Dawley大鼠下丘脑Kiss1基因和雌激素受体α基因表达的发育学变化
目的 应用实时反转录(Real-time) PCR和ELISA法检测不同青春期发育阶段Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠下丘脑Kiss1 mRNA、雌激素受体α(ERα)mRNA的表达水平以及血清黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)水平,探讨Kiss1基因和ERα基因在大鼠性发育过程中的作用.方法 实验动物选用正常3日龄雌性SD大鼠35只,于出生22 d断奶后每日观察阴道开口情况,分别于出生15 d(幼年期组,n=19)和出生35 d(青春期组,n=16)处死动物,分离下丘脑组织,心脏采血法提取血清,标本均置-80℃冰箱保存备测；提取下丘脑标本的RNA,反转录后所得cDNA进行Real-time PCR检测,计算Kiss1基因和ERα基因的mRNA相对表达水平.ELISA方法检测其血清标本LH、E2水平.结果 1.大体观察:观察到青春期组大鼠阴道开口的时间为(32.1±1.0)d,幼年期组在处死前一直未观察到阴道开口.2.Real-time PCR结果显示,青春期组大鼠的Kiss1基因(5.39±2.52)和ERα基因(1.57±1.87)的表达,均显著高于幼年期组Kiss1基因(1.06±1.09)和ERα基因(0.59±0.68),差异均有统计学意义(P均＜0.001).3.ELISA结果显示,青春期组大鼠血清LH[(11.61±0.95) IU/L]和E2[(167.53±31.09) ng/L]水平,均显著高于幼年期组LH[(5.46±1.89) IU/L]和E2[(58.59 ±29.96) ng/L],差异均有统计学意义(P均＜0.001).结论 Kiss1基因和ERα基因参与雌性SD大鼠性发育的启动过程.
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PKC信号通路在KISS1基因抑制人结直肠癌HCT116细胞侵袭迁移的作用
目的:探讨PKC信号通路在KISS1基因发挥抑制结直肠癌细胞HCT116侵袭迁移的作用.方法:构建pGC-LV-KISS1-EGFP慢病毒载体感染人结直肠癌细胞HCT116,分空白对照组(CON组)、空载体对照组(NC组)、过表达组(OE组).qRT-PCR和Western blot检测KISS1基因mRNA和Metastin、PKC信号通路的关键分子PKCα、PKCβII及下游E钙黏蛋白表达量的变化.Transwell法检测细胞侵袭、迁移能力的变化.结果:转染后能够稳定表达报告基因EGFP,荧光率均＞80％,且OE组KISS1基因mRNA、Metastin表达量较CON组和NC组均明显升高(P＜0.05).转染后,PKCβⅡ的蛋白表达量(0.288 2±0.023 7)较CON组(0.530 9±0.013 3)和NC组(0.511 7 ±0.008 5)明显下降(P＜0.05),而PKCα的表达水平无明显变化(P＞0.05);下游效益蛋白E钙黏蛋白表达量(0.633 2±0.017 4)较CON组(0.232 2±0.019 6)和NC组(0.252 3±0.018 2)明显升高(P＜0.05).OE组细胞侵袭、迁移能力较CON组和NC组均明显下降(P＜0.05).结论:KISS1基因可能通过下调PKCβⅡ后上调下游蛋白E钙黏蛋白的表达而发挥抑制结直肠癌细胞HCT116侵袭、迁移作用,有望成为防治结直肠癌转移的新靶点.
