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let-7a-5p在急性呼吸窘迫综合征中作用
目的 探讨let-7a-5p靶向调节转化生长因子-β受体1(transforming growth factor-β receptor 1,TGF-βR1)在急性呼吸窘迫综合征中作用及机制.方法 NIH3T3细胞经转染let-7a-5p mimics或let-7a-5p inhibitor等后,分为let-7a-5p增强组、let-7a-5p增强对照组、let-7a-5p抑制组、let-7a-5p抑制对照组和阴性对照组,检测各组细胞中let-7a-5p的相对表达量,转染成功后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢmRNA相对表达量,采用Western blot法检测各组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢ蛋白相对表达量.将HEK293细胞分为实验组和对照组,分别转染let-7a-5p mimic和阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定2组相对荧光素酶活性的荧光值.结果 转染后let-7a-5p增强组let-7a-5p相对表达量(191 215.66±115 55.57)高于阴性对照组(251.85±85.12)和let-7a-5p抑制组let-7a-5p(1.14±0.22) (P＜0.05),阴性对照组高于let-7a-5p抑制组(P＜0.05);let-7a-5p增强组细胞中Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢmRNA相对表达量低于阴性对照组和let-7a-5p抑制组(P＜0.05),阴性对照组低于let-7a-5p抑制组(P＜0.05);let-7a-5p增强对照组和let-7a-5p抑制对照组Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢmRNA相对表达量与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),5组细胞中TGF-βR1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05);let-7a-5p增强组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢ蛋白表达灰度值低于阴性对照组和let-7a-5p抑制组(P＜0.05),阴性对照组低于let-7a-5p抑制组(P＜0.05),let-7a-5p增强对照组和let-7a-5p抑制对照组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢ蛋白表达灰度值与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);双荧光素酶报告基因检测结果显示,对照组细胞相对荧光素酶活性(1.00±0.00)高于实验组(0.34±0.13)(P＜0.05).结论 let-7a-5可通过抑制TGF-βR1蛋白翻译而减轻肺纤维化,进而延缓急性呼吸窘迫综合征进程.
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三种方法提取血清miRNA效果的比较
目的：比较Trizol法、蛋白酶K消化＋ Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA的效果。方法分别选取2例健康人、2例肺炎患者和2例肺癌患者血清，以Let‐7a‐5p作为目标mRNA ，线虫Cel‐miR‐39‐3p作为内参，分别采用Trizol法、蛋白酶K消化＋ Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA ，以Let‐7a‐5p及Cel‐miR‐39‐3p特异性引物进行反转录PCR ，以反转录PCR产物为模板运用SYBGreen Ⅰ法进行荧光定量PCR检测。结果 T rizol法与蛋白酶K消化＋ Trizol法均能有效提取到血清miRNA ，而沉淀裂解法由于没有对血浆中的RNA进行富集故提取效果不佳。T rizol法提取较蛋白酶K消化＋ T rizol法相比，可以减少蛋白酶K的消化时间且提取效果更好，并且血清与Trizol试剂的体积比为200∶600时效果相对较好。三种方法检测Cel‐miR‐39‐3p的Ct值基本一致。Tr‐izol法和蛋白酶K消化＋ Trizol法在提取过程中加入的内参丢失较少。结论 Trizol法作为总RNA提取的手段适用于血清miRNA提取，通过调整血清与Trizol试剂的用量可使提取到的血清miRNA能够满足试验需要。
关键词： miRNA let-7a-5p Cel-miR-39-3p 提取
