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乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因共表达对肝癌细胞胰岛素样生长因子-2表达的影响
目的 建立HBV X-HCV C共表达蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-2(IGF-2)的影响.方法 双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导人肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-2蛋白表达.结果 质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达共表达蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-2活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X-HCVC蛋白的细胞明显升高.结论 HBV X-HCV C共表达蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-2活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.
关键词： 乙型肝炎病毒 丙性肝炎病毒 X基因 核心基因 胰岛素样生长因子-2 -
中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定
构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件.使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI 和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的 pET-30a载体中;转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.用抗 HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定.结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白.测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69%～92.7%及88.8%～96.8%之间.在佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),高表达量占菌体蛋白18.9%.Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶.HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型奠定了基础.
关键词： 丙性肝炎病毒 非结构区NS5b蛋白 基因克隆 原核表达 融合蛋白 -
乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞端粒酶活性的影响
目的建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞端粒酶活性的影响.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.PCR-ELISA法检测端粒酶活性.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的端粒酶活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调端粒酶活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.
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同个体中HCV高变区1序列变异的研究
HCV高变区1(hypervariable region one,HVR1)基因变异可能与病毒逃避宿主免疫选择作用有关,是病毒在体内持续存在及HCV感染易慢性化的重要原因之一[1].近年来研究发现,HVR1基因可能对HCV的免疫预防有重要作用[2,3].为此,我们选择了长期、多次进行血液透析的HCV感染者作为研究对象,动态观察了HVR1的序列变异.以研究其变异极其规律有重要意义.
