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幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化
目的研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法,为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础.方法采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA,用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入到表达载体pMAL-c2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli TB1).采用IPTG进行诱导表达.用多糖树脂(amylose resin)作为填充料,制备层析柱,将可溶性菌体蛋白进行亲和层析.应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析.结果融合蛋白的分子量约为60 kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34%;纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.结论与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E.coli TB1中能够高效表达;用多糖树脂作为填充料,进行亲和层析的方法,具有良好的纯化效果.
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幽门螺杆菌lpp20基因的克隆与表达
目的克隆及表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)lpp20基因,为探索高效的防治幽门螺杆菌感染的疫苗抗原和诊断抗原奠定基础.方法用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入的表达载体pMAL-C2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli TB1),并在E.coli TB1中进行表达.用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.结果用PCR方法扩增的lpp20基因长度约为540 bp;经酶切、PCR和测序分析,插入到载体的基因片段与文献报道的基因序列一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为18k1Da,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的34%.结论本研究中构建的pMAL-C2X与lpp20基因重组质粒在E coli TB1中能够高效表达目的基因.该重组子的构建为幽门螺杆菌lpp20基因的研究建立了重要的基础.
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幽门螺杆菌 lpp20基因在食品级乳酸菌中的表达及免疫活性鉴定
目的：构建分泌表达幽门螺杆菌 lpp20基因的重组乳酸乳球菌菌株，并鉴定其免疫活性，为研究安全高效的幽门螺杆菌口服疫苗奠定基础。方法：采用 PCR 法从幽门螺杆菌基因组 DNA 中扩增 lpp20基因，将 lpp20先与 T 载体（pMD19－T）连接，进而经双酶切与表达载体 pNZ8149－SPusp45连接，用电穿孔法将重组质粒转入食品级乳酸乳球菌菌株 NZ3900中，并用 Nisin 诱导 Lpp20表达，表达产物通过 Western blot 法鉴定免疫活性。结果：lpp20基因的 PCR 扩增产物大小约为540 bp，重组质粒的酶切、PCR 和测序鉴定结果符合预期；在菌体和培养基中均检出表达的 Lpp20蛋白，重组表达的 Lpp20蛋白相对分子质量约为20000，且具有与小鼠抗幽门螺杆菌血清反应的免疫活性。结论：成功构建了能够分泌表达幽门螺杆菌 Lpp20抗原的乳酸乳球菌菌株，该重组菌株在口服疫苗研究中具有应用潜力。
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幽门螺杆菌1pp20基因在大肠杆菌TB1中诱导表达方法的研究
目的: 研究影响幽门螺杆菌lpp20基因在大肠杆菌TB1中表达的因素,探索高效表达的条件,为幽门螺杆菌疫苗抗原的纯化和生产奠定基础.方法: 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入的表达载体pMAL-c2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli TB1).采用不同的诱导时间、IPTG浓度和诱导温度进行诱导表达,应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.结果: 在诱导1～4 h之间,融合蛋白的表达量变化较为显著,而4～8 h之间则无显著变化;IPTG终浓度低于0.2 mmol/L或高于3.2 mmol/L均能显著减少融合蛋白的表达量(P<0.05),而IPTG终浓度在0.4～2.4 mmol/L之间时,对融合蛋白的表达量并无显著影响;诱导温度在30 ℃～40 ℃之间变化对融合蛋白的表达量无显著影响,超出此范围可使表达量显著减少(P<0.05);在优化诱导条件后,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白的34%.结论: 通过调整诱导时间、IPTG浓度和诱导温度,lpp20基因与载体pMAL-c2X的重组质粒在E.coli TB1中能够高效表达.
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幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究
目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.
