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miR-20a对肺泡上皮细胞A549合成肺表面活性物质的影响及其机制
目的 研究miR-20a对肺泡上皮细胞A549合成肺表面活性物质的影响及其可能的作用机制.方法 将成功构建的miR-20a过表达慢病毒载体(miR-20a组)与空载慢病毒(空载组)分别转染A549细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定转染效率;采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况;生物信息学方法预测miR-20a促进肺发育的潜在相关靶基因;实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-20a、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)、肺表面活性物质相关蛋白B(SP-B)、肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)和肺表面活性物质相关蛋白D(SP-D) mRNA的表达;免疫印迹法检测SP-A、SP-B、SP-C、SP-D及信号转导及转录活化因子3(STAT3)蛋白水平.结果 通过绿色荧光表达观察到慢病毒成功转染入A549细胞,RT-PCR提示转染miR-20a过表达慢病毒载体后miR-20a的表达(3.85-±0.18)较正常组(0.99±0.04)及空载组(1.21±0.12)显著增高,差异均有统计学意义(t=10.85、9.64,均P＜0.001),细胞株成功建立.与正常组(24 h、48 h、72 h:0.23±0.01、0.39±0.01、0.56±0.03)及空载组(24 h、48 h、72 h:0.25±0.01、0.44±0.05、0.59±0.01)比较,miR-20a对不同时间的A549细胞增殖(24 h、48 h、72 h:0.26±0.01、0.41±0.02、0.58 ±0.02)无影响,差异均无统计学意义(均P＞0.05).在线软件预测发现STA T3基因很可能是miR-20a的靶基因.与正常组(1.00±0.05、1.24±0.20、1.31 ±0.09、0.89±0.12)及空载组(0.76±0.10、1.31±0.13、1.50±0.11、1.01 ±0.11)比较,miR-20a可上调SP-A、SP-B、SP-C和SP-D mRNA的表达(2.05±0.17、2.14±0.10、2.84±0.09、1.66±0.08),差异均有统计学意义(均P＜0.05).与正常组(0.46±0.01、0.27±0.03、0.69±0.01、0.43±0.01)及空载组(0.43±0.01、0.21±0.01、0.79±0.02、0.44±0.02)比较,miR-20a也可上调SP-A、SP-B、SP-C和SP-D蛋白的表达(0.55±0.01、0.47±0.05、0.96±0.02、0.59±0.03),差异均有统计学意义(均P＜0.05)..与正常组(0.60±0.04)及空载组(0.68±0.06)比较,miR-20a组STAT3表达水平(0.37±0.05)显著降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 STAT3是miR-20a的靶基因,miR-20a很可能通过抑制STAT3表达来促进A549细胞合成肺表面活性物质.
关键词： miR-20a 肺表面活性物质 肺泡上皮细胞A549
