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杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白基因的克隆及原核表达
目的:构建杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白.方法:根据GenBank上杜氏盐藻MAR结合蛋白的cDNA全长序列设计出含有特定酶切位点的引物,PCR法获得MAR结合蛋白基因序列全长,将其克隆至载体pMD18-T中.酶切连接到pET-28a(+)上构建原核表达载体pET-MBP,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,Western blotting检验其表达结果.结果:重组质粒经酶切、PCR、测序鉴定,成功构建了原核表达载体pET-MBP,对表达的融合蛋白的Western blotting分析结果表明表达的蛋白质为目的蛋白.Ni2+亲和层析法纯化蛋白质,纯化后目的蛋白在总蛋白中的含量约为70%.结论:成功地克隆杜氏盐藻MAR结合蛋白基因的全长并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,且纯化了MAR结合蛋白的融合蛋白.
关键词： 杜氏盐藻 核基质附着区 核基质附着区结合蛋白 原核表达 -
人β-珠蛋白核基质附着区介导表达载体稳定附着于中国仓鼠卵巢细胞
目的 研究人β-珠蛋白核基质附着区是否能够介导表达载体稳定附着于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞.方法 人β-珠蛋白MAR序列克隆到pEGFP-C1构建重组质粒载体pEGFP-MAR,转染CHO细胞,使用Hirt裂解法提取细胞中附着体质粒,CaCI2法转化附着体质粒到宿主大肠杆菌DH5a中,提取质粒,酶切,测序分析.结果 还原质粒双酶切和单酶切结果均与转染前质粒酶切结果一致;测序分析得知还原质粒与转染前质粒中插入片段DNA序列相同.结论 人β-珠蛋白MAR序列重组载体在CHO细胞中以附着体形式被完整还原出来.还原质粒酶切结果和测序结果均与转染前质粒一致.
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重组中国仓鼠卵巢细胞表达系统高效表达载体研究进展
生物制药是21世纪高科技产业,治疗性重组蛋白的生产是生物制药的重要部分.宿主细胞以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用途为广泛,近70％宿主细胞是用CHO细胞表达系统生产的.影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多,其中表达载体是重要因素之一.构建重组CHO细胞表达系统高效表达载体可以利用核基质附着区、泛在染色质开放元件,构建特定位点重组载体系统,以及选择合适的内部核糖体进入位点及弱化筛选标记等实现.CHO细胞表达高效载体构建涉及多个因素,需要进行不同元件的优化,才可达到高效表达.
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人T细胞基因组随机MARs的分离、克隆及序列分析
目的分离、克隆人基因组随机MARs片段,分析其序列特征,为进一步研究MARs在真核细胞DNA复制及基因表达调控中的作用与机制奠定基础.方法用DNaseⅠ、高盐和蛋白酶K处理细胞核,分离人T细胞基因组随机MARs片段,并将其克隆进入PUC19质粒;用体外结合实验筛选能与核基质蛋白结合的克隆并测序,生物信息学分析其序列的特征.结果从人T细胞基因组中分离得到大量的MARs片段,构建成MARs库,初步任意挑选58个克隆,体外结合实验证实其具有与核基质蛋白结合活性,对其中1个克隆的序列分析表明,其序列AT含量较高,不仅含有AC-和ATAT基序,还包含有多个转录/复制起点、增强子序列、弯曲DNA和扭结DNA基序以及多个反向重复序列.结论分离获得的DNA片段具有MAR的特性,同一DNA序列中存在不同的元件组合,其参与基因表达调控的功能应该是复杂、多样的.
