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抗亨廷顿蛋白相关蛋白1氨基末端和羧基末端多肽抗体的制备
目的 探讨抗亨廷顿蛋白相关蛋白1(HAP1)异构体——HAP1A和HAP1 B的氨基末端和羧基末端多肽抗体的制备.方法 对大鼠脑总RNA进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)获取HAP1氨基末端多肽(HAP1 N)基因片段,并插入载体构建HAP1N原核表达质粒.提取原核表达的谷胱甘肽转硫酶(GST)-HAP1N末端、GST-HAP1AC末端和GST-HAP1BC末端的融合蛋白,免疫豚鼠和兔分别制备抗HAP1 N、HAP1 A和HAP1 B抗体,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法和免疫组织化学技术对其特异性和效价进行鉴定和检测.结果 构建的HAP1 N原核表达质粒经酶切和DNA测序鉴定显示,目的基因插入部位正确,长度符合设计要求,为大鼠HAPl氨基末端片段基因.电泳结果显示,提取的3种融合蛋白相对分子质量大小与设计表达的目的蛋白相吻合.获得了豚鼠或兔分别抗3种融合蛋白的抗体,能与提取的融合蛋白特异性结合.豚鼠/兔抗HAP1N(TJ1N GP/TJ1NRB)可同时识别下丘脑提取组织的HAP1A和HAP1B,其特异性与国外的豚鼠/兔抗HAP1中间段序列抗体EM78相同,豚鼠抗HAP1AC(TJ1ACGP)特异性识别HAP1A,豚鼠/兔抗HAP1BC(TJ1BCGP或TJ1BCRB)特异性识别HAP1B；TJ1NRB、TJ1BCRB、TJ1NGP、TJ1ACGP和TJ1BCGP5种抗体均能有效标记大鼠脑组织的HAP1,TJ1NRB、TJ1BCRB、TJ1NGP和TJ1BCGP免疫反应阳性物的分布与EM78完全一致,TJ1ACGP免疫反应阳性物主要以颗粒状形式定位在Stigmoid小体上,弥散分布产物极少；3种检测结果显示5种抗体的效价均达1∶10000以上.结论 针对HAP1 A和/或HAP1B氨基末端和羧基末端多肽抗体特异性识别HAP1A和/或HAP1B,可用于HAP1的研究；针对HAP1A/HAP1B氨基末端多肽抗体和HAP1B羧基末端多肽抗体可替代针对HAP1中间段多肽抗体.
