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转sck基因水稻中标记基因表达蛋白HPT食用安全性的初步研究
目的针对抗虫转sck基因水稻中标记基因表达蛋白HPT的食用安全性开展初步研究,主要包括该蛋白在大米中的定性、定量研究、可能的膳食摄入量估计及其潜在致敏性评估等.方法将HPT的编码序列插入带有组氨酸标签(His-tag)的原核表达载体PBV222中进行融合表达,通过脲变性和镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白.用纯化后的6His-HPT蛋白免疫家兔和小鼠,分别制备相应的抗HPT多克隆和单克隆抗体,进一步将这两种抗体组成双抗夹心酶联免疫检测体系,用于检测HPT在转sck基因水稻中的表达水平.在致敏性评估方面,首先将HPT序列与已知的致敏原数据库进行比较,再利用模拟的胃肠液环境进行体外消化稳定性实验.结果重组体经表达纯化后获得了高纯度(95%)的6His-HPT融合蛋白,免疫动物后获得了高效价的抗HPT多克隆及单克隆抗体,经免疫印迹检测证明所制备的抗体可与转基因水稻中及纯化出的HPT蛋白形成特异结合带.由这两种抗体组成的双抗夹心酶联免疫检测体系用于检测HPT抗原时的灵敏度为30ng/ml,可检测出转sck基因水稻叶片中HPT蛋白的表达量约为80～150ng/ml;而在相应的转基因大米中未能检出.HPT序列经与已知的致敏原数据库进行比较未见同源性,但在体外消化稳定性实验中,HPT蛋白在模拟的胃肠液环境中均迅速降解.结论就目前的检测水平来看,转sck基因大米中所含的HPT蛋白水平极低,且对消化环境不稳定,推测该标记基因表达蛋白不易引起可观察到的食用安全性问题.但利用表达的HPT蛋白直接进行动物急性毒性及致敏性实验的工作仍有待进行,有关的结果将进一步报道.
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抗小鼠移码因子1蛋白多抗制备及其在脂肪细胞分化中的表达
目的 制备小鼠上游移码因子1(UPF1)蛋白多克隆抗体并探讨脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白的表达.方法 构建UPF1蛋白表达载体,制备并纯化兔抗小鼠UPF1抗体;诱导3T3-L1细胞分化,并用免疫共沉淀(CoIP)方法观察脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白的表达.结果 1)制备了效价≥64万且与重组mUPF1蛋白和天然mUPF1蛋白均有很强的特异性结合能力的兔抗小鼠UPF1的多克隆抗体;2)小鼠3T3-L1细胞成脂诱导过程中UPF1蛋白表达量未发生明显变化;3)脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白与UPF2蛋白相互作用增加.结论 1)以mUPF1蛋白C端550个氨基酸为抗原制备的抗体能够有效识别mUPF1蛋白;2)在脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白与UPF2蛋白互作增强.
关键词： 脂肪细胞分化 上游移码因子1 无义介导的mRNA降解 抗体制备 -
细粒棘球绦虫胰岛素受体蛋白原核表达及其多克隆抗体制备
目的 制备细粒棘球绦虫胰岛素受体(EgIR)蛋白的多克隆抗体,为进一步研究EgIR蛋白的功能提供检测抗体.方法 利用Gamier-Robson、Chou-Fasman、DNAMAN等软件预测EgIR蛋白抗原表位,进行引物序列设计.将预测的EgIR基因部分序列克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化E.coli ROSETTA(DE3)株,IPTG诱导蛋白表达,表达产物EgIR蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱纯化后注射免疫家兔10 d,收集免疫血清,采用ELISA法测定抗体效价,采用Western blot检测制备的多克隆抗体与EgIR蛋白的结合特性.结果 构建的原核表达载体转化DE3后经0.8mmol/L IPTG诱导,成功表达约55 ku的EgIR重组蛋白;目的蛋白纯化后的浓度为3 mg/ml,纯度为85％;免疫家兔后收集的血清经ELISA法检测,抗体效价＞1∶51 200;Western blot检测该抗体能与10、5、1 ng/ml的EgIR重组蛋白特异结合,该抗体1∶1 000稀释后仍可检测到原头蚴、囊泡蛋白样品中的胰岛素受体蛋白.结论 成功制备兔抗EgIR亚基多克隆抗体,为EgIR蛋白的功能和药物靶标研究奠定了基础.
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EB病毒潜伏膜蛋白2B表位特异性兔血清抗体的制备和鉴定
目的 制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体.方法 利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并经BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点克隆至pET32a(+)载体,测序鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),用异丙基硫代-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.用镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化表达产物,与佐剂乳化后皮下多点注射日本大耳白兔,隔周免疫1次,共3次.分别于免疫的0、2、4、6、8周取血,采用ELISA方法检测IgG抗体水平,采用Western blot和细胞免疫荧光法检测兔血清抗体的免疫反应性和结合特异性.结果 EBV LMP2 B表位重组蛋白可通过原核表达系统进行表达,纯化的表达蛋白免疫兔可产生特异性IgG抗体,效价达1∶30 000.经Westernblot法和细胞免疫荧光法鉴定,制备的兔血清抗体可识别LMP2重组蛋白和LMP2天然蛋白.结论 成功获得了EBV LMP2串联B表位重组蛋白,制备的兔多克隆血清抗体效价高,特异性强,为LMP2的生物学和免疫学研究奠定了基础.
关键词： EB病毒潜伏膜蛋白2 原核表达 抗体制备 -
小鼠趋化因子受体CXCR3胞外N末端的原核表达、抗体制备及初步应用
趋化因子受体为与G蛋白偶联、含有7个跨膜区的跨膜蛋白,依其结构特点又可分为多个亚类,其中CXCR3主要表达于激活的T细胞、B细胞和NK细胞表面,其高表达是淋巴细胞发生定向迁移和募集的重要条件,在炎症浸润、细胞迁移、血管形成、移植排斥反应和某些肿瘤的发生中都起着重要的作用.1
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不同免疫策略获得c-erbB2单克隆抗体及其结合特性的比较
人类c-erbB2/HER2原癌基因属于EGFR家族.将c-erbB2真核表达载体转染NIH3T3细胞,可赋予该细胞以恶性表型[1];1998年由鼠源抗erbB2抗体人源化改造而来的Herceptin(商品名)已被美国FDA批准用以治疗c-erbB2高表达的转移乳腺癌,并已获得较好的临床治疗效果[2].本工作采用不同免疫策略获得了数株c-erbB2单抗,并对其与靶分子的结合特性进行了比较分析,提出了相对更易获得能与天然erbB2结合的抗体制备策略,可供后续工作参考.
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人甲状旁腺激素多肽抗体制备及纯化方法研究
人甲状旁腺激素(hPTH)是维持机体钙磷平衡等生命活动的重要激素, hPTH 1-84、1-34、1-37、44-68、54-84是人体中重要的免疫活性片段[1].HPTH 1-84的分子量为9 500,介于完全抗原和半抗原之间.由于抗hPTH 1-84抗体可测定任何具有免疫活性的hPTH片段, 因此具有重要应用价值.本研究用基因工程表达hPTH 1-84制成3种免疫原,分别免疫家兔后制备抗体,并对特异抗hPTH 1-84抗体和载体BSA抗体的效价进行比较.同时,分别用盐析、Q膜、蛋白A和免疫亲和层析纯化方法对抗hPTH 1-84抗体的纯度、活性和回收率进行研究.
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金黄色葡萄球菌β-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备
目的 利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌外分泌毒素β-溶血素(β-hemolysin , Hlb )及其突变体HlbH-149-N ,检测其生物学活性,并制备其功能性抗体,探讨Hlb蛋白在金葡菌感染中的生物学意义. 方法 以金葡菌NCTC-8325基因组为模板,利用PCR技术扩增目的基因hlb,进一步构建重组表达载体pET28a-hlb,并转至大肠杆菌BL21(DE3),利用点突变技术构建重组表达载体pET28a-hlbH-149-N,经IPTG诱导表达目的蛋白,通过Ni2+柱亲和纯化获得Hlb蛋白及突变体HlbH-149-N蛋白;通过溶血实验检测Hlb及突变体HlbH-149-N蛋白的生物学活性,并制备Hlb特异性抗体,检测抗体的中和活性. 结果 获得了纯度较高的重组Hlb蛋白和突变体HlbH-149-N蛋白,溶血活性实验结果表明,重组Hlb蛋白能够裂解绵羊红细胞,而突变体HlbH-149-N蛋白不能裂解绵羊红细胞;不同物种红细胞对Hlb敏感性不同;制备了抗Hlb蛋白的多克隆抗体(anti-Hlb),ELISA和Western印迹实验结果表明,anti-Hlb能特异结合Hlb蛋白和突变体HlbH-149-N蛋白,同时发现,anti-Hlb可有效抑制Hlb对绵羊红细胞的裂解作用. 结论 获得了具有良好溶血活性的重组Hlb蛋白以及无溶血活性的突变体HlbH-149-N蛋白,并制备了具有中和活性的特异性抗体,为深入研究Hlb在金葡菌致病过程中的作用奠定了基础.
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丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备
用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase, SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达;对影响可溶性表达的4个因素,即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行了优化.结果发现在宿主菌A600达到1.0时加入0.4mmol·L-1 IPTG,在20℃诱导培养8h表达的可溶性蛋白量高,约占细胞总蛋白的35.6%.用Ni2+亲和色谱法纯化表达产物,纯化蛋白产率达到12.3mg·L-1.将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清,ELISA测定效价为1:24300,且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原,获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础.
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兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体的制备及初步鉴定
目的 狨猴血清中纯化IgG抗体,制备兔抗狨猴抗血清,并纯化抗血清中IgG,HRP(辣根过氧化物酶)标记兔抗狨猴IgG.方法 HiTrapTMProtein G亲和层析纯化狨猴和兔抗狨猴血清IgG,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度鉴定,免疫琼脂双扩散法(double immunodiffusion assay)测定制备的兔抗狨猴抗血清效价,改良"简易过碘酸钠标记法"制备兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体,酶联免疫吸附测定法( ELISA)及蛋白免疫印迹法(Western blotting)对兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体进行工作浓度测定及特异性鉴定.结果 狨猴和兔抗狨猴血清纯化IgG纯度分别大于95% 、97% ;兔抗狨猴IgG抗血清的效价为1∶64. ELISA和Western blotting鉴定了兔抗狨猴IgG-HRP酶标抗体参考工作浓度为1∶256 000、1∶15 000,特异性明显.结论 制备狨猴IgG-HRP标记抗体并初步鉴定,包括ELISA及Western blotting的特异性及使用浓度,为狨猴病原体免疫学检测体系及分子免疫学检测体系储备了资源.
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沙鼠前脑缺血后脑红蛋白的表达变化
脑红蛋白(neuroglobin,NGB)是继血红蛋白和肌红蛋白之后发现的第三类携氧球蛋白,它主要在脑内高表达,可特异性地为脑供氧[1].NGB的发现开辟了脑缺氧研究的新方向,也为治疗缺血缺氧性脑疾病带来了新的希望.本实验室在国际上率先克隆了大鼠和人NGB的全长cDNA序列,并进行了组织分布、抗体制备等一系列研究[2-4].已有研究表明,缺氧和NGB的表达密切相关[5].在临床上,脑缺血尤其是各种原因导致的急性脑缺血是脑缺氧损伤性疾病的重要原因,而目前关于脑内缺血缺氧性损伤后NGB表达的变化情况尚缺乏详细资料.为此,我们采用沙鼠脑缺血模型系统地研究了急性脑缺血后脑内NGB在不同时间点表达的变化情况,旨在为脑缺血缺氧相关疾病的发病机理和临床治疗提供依据.
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蛋白AAX14401相应抗体的制备及鉴定〔1〕
目的：由AY887902完整读码框翻译的蛋白AAX14401，制备蛋白AAX14401相应抗体anti-AY，并对其进行鉴定。方法：以AY887902的ORF所翻译氨基酸与GSTP1相比差异较大的40~52位上氨基酸序列为模板，按照抗体制备要求，合成多肽并免疫小鼠，制备蛋白AAX14401多克隆抗体anti-AY。结果：经过用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）检测，抗体滴度为1：35000，滴度达到要求，可以进行蛋白 AAX14401的检测。结论：制备的蛋白AAX14401抗体anti-AY符合要求，为进一步对AY887902功能进行检测奠定了较好的基础。
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抗双胸蚓核酸酶EWD2多克隆抗体的制备及鉴定
目的 将从双胸蚓组织中纯化的核酸酶EWD2免疫新西兰大白兔制备兔抗EWD2多克隆抗体.方法 将纯化的双胸蚓核酸酶EWD2免疫新西兰兔,制备兔抗EWD2血清,以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价.结果 EWD2蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体.Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1∶6 000. 结论 获得了双胸蚓核酸酶EWD2多抗血清,为今后对双胸蚓核酸酶活性和结构的研究建立了基础.
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卵黄囊抗体制备及其应用研究进展
卵黄囊抗体即卵黄免疫球蛋白(Egg Ydk Immunoglobulin,IgY)是抗原免疫禽类后由卵黄中分离得到的特异性抗体.与哺乳动物来源的IgG比较,卵黄囊抗体具有取材方便、分离纯化方法简单、产量高,同时具有特异性高、稳定性较好等优点,在疾病诊断、防治等诸多方面得到了广泛的应用,一直是生命科学相关科研领域的研究热点.本文就卵黄囊抗体的分离纯化方法及其应用研究进展作一综述.
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兔抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定
背景:凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白,它不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用.目的:制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2008-08在新乡医学院免疫学研究中心完成.材料:新两兰大白兔雌性2只.体质量1.9～2.1 kg;JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司.食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者.抗原肽-KLH由上海华大天源生物科技公司合成.CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司.方法:利用美国过敏和感染疾病研究所(NIAID)主办的抗原表位分析网站(http://beta.immuneepitope.org/home.php)的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽,制备多克隆抗体并纯化.主要观察指标:采用间接ELISA、Western blot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定.结果:间接ELISA法检测显示,血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1:128000.Western blot结果显示,存在Mr67000条带.免疫组织化学检测结果显示,在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在,说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色.结论:实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体.
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帕金森病相关蛋白α-共核蛋白的可溶性表达、纯化及抗体制备
目的利用分子克隆技术在原核细胞中表达α-共核蛋白(SNCP),并制备兔多克隆抗体.方法从人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA.利用PCR技术扩增获得SNCP的cDNA序列,测序正确后克隆至pQE-30-GST表达载体上,在大肠埃希菌中表达GST-SNCP融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备特异性抗血清,并对该抗体进行检测.结果琼脂糖凝胶电泳显示获得的SNCPcD-NA序列为420bp.SDS-PAGE和Western blot分析,表达的融合蛋白呈可溶性,相对分子质量约为45000.以其为抗原制备的SNCP抗血清的ELISA效价达到1:32000,并且该抗体可与BALB/c小鼠脑组织中内源性SNCP发生特异性反应.结论人SNCP可在原核细胞中可溶性表达.用表达的蛋白制备获得特异性较好的SNCP抗血清,为进一步了解SCNP的结构和功能以及在中枢神经系统退行性疾病的作用提供了必要的实验基础.
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肠三叶因子在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗体制备
目的:获得肠三叶因子(ITF)的原核表达产物及抗rITF抗体,为深入研究ITF的作用机制及其受体研究奠定基础.方法:常规提取人小肠组织总RNA,用RT-PCR获得ITF编码基因片段,克隆至质粒pET32a获得原核表达载体,双酶切和测序后转化至OrigamiB(DE3)用IPTG诱导表达,优化条件获得大表达产量;用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物,亲和层析纯化获得的重组蛋白rITF皮下多点注射家兔,制备多克隆抗体,并用此抗体进行大鼠肠组织免疫组化研究.结果:测序证实PCR扩增获得ITF全长基因序列与基因文库中的完全一致,将该基因片段正确插入表达载体pET32a中、优化表达条件后,重组蛋白的表达量达到50mg/L;Western blot证明重组蛋白具有良好的抗原性和特异性;通过Ni-NTA亲和层析、超滤离心后,得到90%纯度的蛋白;收集兔血清,纯化后获得特异性良好的ITF抗体,免疫组化染色肠组织显示ITF表达的部位定位于杯状细胞.结论:成功构建了表达载体pET32a-ITF,在大肠杆菌中表达并纯化获得纯度较高的rITF,并获得了生物活性较高的ITF抗体,ITF主要在肠道杯状细胞分泌表达.
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鼠疫菌PsaA抗原的表达及抗体制备和应用
目的:制备鼠疫菌PsaA抗原及抗体,建立针对PsaA抗体的快速检测方法,并检测鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率.方法:利用PCR方法扩增出PsaA蛋白基因片段,在大肠杆菌原核表达系统中表达出重组PsaA抗原,以镍柱亲和层析纯化包涵体形式的表达蛋白,以尿素梯度透析复性成可溶蛋白.再以表达蛋白为免疫原,常规免疫家兔,收集兔血清制备多抗,并以正辛酸-硫酸铵法提纯获得PsaA抗体IgG.利用得到的PsaA抗原和抗体为材料,建立两种检测PsaA抗体的快速检测方法,即间接ELISA法和上转换发光(Up-converting Phospher Technology,UPT)免疫层析试纸条法.后利用这两种方法检测18份猴血清标本中的PsaA抗体.结果:鼠疫菌感染猴血清标本中PsaA抗体的阳性率为62%(8/13).结论:成功建立了针对鼠疫菌PsaA抗体的快速检测方法,并检测到13份鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率为62%.
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Jα33基因工程蛋白与多克隆抗体的制备及初步应用
为了获得同时识别人类和小鼠MAIT细胞的特异性抗体,我们制备了MAIT细胞TCRα链Jα33融合蛋白及其抗体,为MAIT细胞在炎症性肠道疾病(IBD)中作用的研究提供有利的工具.用Jα33的全长序列为引物经PCR扩增Jα33串联体,扩增的串联体片段连接进入T载体,阳性克隆转入pGEX-4T-1表达载体中原核表达GST-Jα33融合蛋白,纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备anti-Jα33多克隆抗体.并分别用Western blot和RT-PCR检测IBD模型小鼠MAIT细胞Jα33的表达.成功获得分子量约为38 kD的融合蛋白,免疫大白兔后得到抗Jα33的多克隆抗体,Western blot结果显示Jα33多克隆抗体能检测到人外周血单个核淋巴细胞表面Jα33的表达,而HeLa中则无Jα33的表达；MAIT细胞Jα33在IBD小鼠肠组织中表达量明显低于正常对照.成功制备了能同时识别人类和小鼠MAIT细胞Jα33的多克隆抗体,为研究MAIT细胞的定位和功能开启了方便之门.
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小鼠钙网蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备
钙网蛋白(calreticulin,CRT)是存在于哺乳动物细胞具有高度保守性和多种生物学活性的蛋白,为了更好的研究其生物学活性,本课题组通过PCR方法扩增CRT截短基因,将其克隆到原核表达载体PET-28a(+)中,经大肠杆菌表达并纯化CRT蛋白.以纯化的CRT蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,制备多克隆的CRT血清.进一步采用Western blot、ELISA、流式细胞术等技术对制备的抗体进行初步鉴定.结果显示:原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达CRT蛋白；获得多抗血清应用Western blot鉴定几种细胞株中CRT,流式细胞术检测CRT的外翻现象.因此我们得到结论——成功制备了CRT蛋白及其抗体,并有很好的特异性,能识别人鼠两种源性的CRT.
