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生物素修饰蛋白文献资料
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生物素修饰蛋白真核表达载体的构建与应用
目的 构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法.方法 采用PCR和引物退火的方法,得到BirA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至pcDNATM3.1载体骨架上,构建得到生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA.应用PCR方法扩增Her2胞外段-Fc基因片段,定向克隆至载体pAvi-BirA上;将该质粒瞬时转染HEK293F细胞,并在培养液中添加不同剂量的生物素.通过Western印迹检测BirA酶和Her2胞外段-Fc融合蛋白的表达水平以及目的蛋白的生物素修饰效率.结果 经PCR鉴定、 酶切鉴定和基因测序显示pAvi-BirA载体构建成功.Western印迹结果表明pAvi-BirA载体转染HEK293F细胞后,BirA酶在细胞中表达良好.在HEK293F细胞中瞬时转染含有Her2胞外段-Fc基因片段的载体后,融合蛋白得到高效表达,并且能够有效进行生物素修饰.随着生物素添加剂量的增加,目的蛋白生物素修饰比例逐渐升高;当生物素母液(5 mmol/L)添加剂量为2μl/ml时,蛋白生物素修饰水平不再提高.结论 构建了生物素修饰蛋白真核表达载体,优化了生物素修饰蛋白制备方法,为相关领域科学研究提供了可靠的技术基础.
