首页 > 文献资料
-
基于 Avi-tag技术的双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白
目的：利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白（ EGFP）。方法：PCR方式扩增EGFP基因片段，重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体 pdi-Avitag，构建原核表达载体pEGFP-（Avitag）2并转化E.coli DH5α；表达菌株菌体冻融上清经金属离子亲和色谱纯化目的蛋白EGFP-（ Avitag）2，以BirA酶体外催化生物素分子与目的蛋白在Avi-tag位点的生物连接，并以 Western blot和竞争ELISA鉴定生物素化产物EGFP-B2的生物素化效果。结果：成功构建pEGFP-（Avitag）2载体，并在E.coli DH5α中可溶性表达EGFP-（Avitag）2，经Western blot和竞争ELISA鉴定， EGFP-（ Avitag）2分子经BirA酶体外催化可连接两个生物素分子。结论：成功获得双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白，为其在BAS体系中的应用奠定了研究基础。
-
生物素修饰蛋白真核表达载体的构建与应用
目的 构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法.方法 采用PCR和引物退火的方法,得到BirA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至pcDNATM3.1载体骨架上,构建得到生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA.应用PCR方法扩增Her2胞外段-Fc基因片段,定向克隆至载体pAvi-BirA上;将该质粒瞬时转染HEK293F细胞,并在培养液中添加不同剂量的生物素.通过Western印迹检测BirA酶和Her2胞外段-Fc融合蛋白的表达水平以及目的蛋白的生物素修饰效率.结果 经PCR鉴定、 酶切鉴定和基因测序显示pAvi-BirA载体构建成功.Western印迹结果表明pAvi-BirA载体转染HEK293F细胞后,BirA酶在细胞中表达良好.在HEK293F细胞中瞬时转染含有Her2胞外段-Fc基因片段的载体后,融合蛋白得到高效表达,并且能够有效进行生物素修饰.随着生物素添加剂量的增加,目的蛋白生物素修饰比例逐渐升高;当生物素母液(5 mmol/L)添加剂量为2μl/ml时,蛋白生物素修饰水平不再提高.结论 构建了生物素修饰蛋白真核表达载体,优化了生物素修饰蛋白制备方法,为相关领域科学研究提供了可靠的技术基础.
