首页 > 文献资料
-
基于 Avi-tag技术的双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白
目的：利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白（ EGFP）。方法：PCR方式扩增EGFP基因片段，重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体 pdi-Avitag，构建原核表达载体pEGFP-（Avitag）2并转化E.coli DH5α；表达菌株菌体冻融上清经金属离子亲和色谱纯化目的蛋白EGFP-（ Avitag）2，以BirA酶体外催化生物素分子与目的蛋白在Avi-tag位点的生物连接，并以 Western blot和竞争ELISA鉴定生物素化产物EGFP-B2的生物素化效果。结果：成功构建pEGFP-（Avitag）2载体，并在E.coli DH5α中可溶性表达EGFP-（Avitag）2，经Western blot和竞争ELISA鉴定， EGFP-（ Avitag）2分子经BirA酶体外催化可连接两个生物素分子。结论：成功获得双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白，为其在BAS体系中的应用奠定了研究基础。
-
sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测
目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术.方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4∶1结合而形成HLA-A*0201-LMP2A426-434四聚体.获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测,同时用细胞毒实验验证.结果:荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A*0201-抗原肽复合物分子正确结合,制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合.结论:从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A*0201-抗原肽复合物四聚体.为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础,也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法.
-
生物素修饰蛋白真核表达载体的构建与应用
目的 构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法.方法 采用PCR和引物退火的方法,得到BirA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至pcDNATM3.1载体骨架上,构建得到生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA.应用PCR方法扩增Her2胞外段-Fc基因片段,定向克隆至载体pAvi-BirA上;将该质粒瞬时转染HEK293F细胞,并在培养液中添加不同剂量的生物素.通过Western印迹检测BirA酶和Her2胞外段-Fc融合蛋白的表达水平以及目的蛋白的生物素修饰效率.结果 经PCR鉴定、 酶切鉴定和基因测序显示pAvi-BirA载体构建成功.Western印迹结果表明pAvi-BirA载体转染HEK293F细胞后,BirA酶在细胞中表达良好.在HEK293F细胞中瞬时转染含有Her2胞外段-Fc基因片段的载体后,融合蛋白得到高效表达,并且能够有效进行生物素修饰.随着生物素添加剂量的增加,目的蛋白生物素修饰比例逐渐升高;当生物素母液(5 mmol/L)添加剂量为2μl/ml时,蛋白生物素修饰水平不再提高.结论 构建了生物素修饰蛋白真核表达载体,优化了生物素修饰蛋白制备方法,为相关领域科学研究提供了可靠的技术基础.
-
可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化
目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化.方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠,形成HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体,并在BirA酶的作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-pBRLF1复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体.利用特异单抗(W6/32和兔抗人β2 m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物.然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA-A*2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞(aAPCs)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL).结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化.应用HLA-A*2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA-A*2402-pBRLF1四聚体.结论 HLA-A*2402-pBRLF1四聚体构建成功,为特异性CTL的检测提供了有力的工具.
关键词： HLA-A*2402-pBRLF1复合物 生物素化 BirA酶 四聚体 -
生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备
目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物.方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体.利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人β2微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物.结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化.结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础.
关键词： HLA-A*2402-抗原肽复合物 生物素化 BirA酶 -
BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定
目的: 构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21 (DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶.方法:用PCR法扩增BirA酶基因.将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA.经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化.以带有生物素酶底物肽(BirA substratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Western blot鉴定表达产物的生物素化活性. 结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61 300 的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白. ELISA和Western blot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化. 结论: 成功地制备了具有生物学活性的BirA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂.
关键词： BirA酶 生物素化 HLA-A2-肽复合物 -
可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化
目的: 可溶性HLA-A2-抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化.方法: 原核高效表达的HLA H链及β2m, 在抗原肽(EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2-CLGGLLTMV-COOH残基)的存在下, 通过稀释复性折叠成HLA-A2-抗原肽复合物, 并在BirA酶的作用下进行生物素化, 使生物素结合到HLA-A2-抗原肽复合物中的H链C端.利用特异性抗体 (mAb W6/32和兔抗人β2m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot, 检测稀释复性和生物素化的折叠产物. 结果: 折叠复合物中, 主要含有HLA H链聚合体、HLA-A2-肽复合物单体及β2m 3种成分, 其中H链聚合体与HLA-A2单体可生物素化.结论: 成功地获得生物素化的HLA-A2-抗原肽复合物单体, 为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础, 也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体的制备提供了可行的免疫学监控方法.
关键词： HLA-A2-抗原肽复合物 生物素化 BirA酶
