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SM22α启动子慢病毒载体的构建及感染研究
目的 构建以SM22α启动子驱动EGFP表达的慢病毒载体,研究此载体在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中表达的效率和特异性.方法 从小鼠的基因组中采用PCR扩增SM22α启动子,将目的基因连接至T载体,并进行测序鉴定,将目的基因重组至pGC-FU载体,三质粒系统采用脂质体介导转染293T细胞进行病毒包装,体外感染VSMCs,大鼠动脉内皮细胞,人乳腺癌细胞系SK-BR-3,荧光显微镜观察EGFP的表达情况.结果 PCR扩增得到的SM22α启动子经测序证实正确;成功构建了SM22α启动子驱动EGFP的慢病毒载体LV-SM22α-EGFP,SM22α启动子能调控EGFP在VSMCs中高效表达,感染效率在95%以上,在血管内皮细胞和人乳腺癌细胞系SK-BR-3中不表达,对照慢病毒组EGFP在三种细胞中均表达,在VSMCs的感染效率在30%左右,且表达较低.结论 SM22α启动子能够特异性驱动EGFP在VSMCs中表达,LV-SM22α-EGFP能作为研究血管疾病的良好基因转移载体.
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SM22α启动子/增强子基因调控磷酸肌醇3激酶信号通路对移植血管新生内膜增生的影响
目的 采用组织特异性启动子SM22α,构建靶向大鼠磷脂酰肌醇3激酶β亚单位(Pik3cb)的短发卡RNA(shRNA)真核表达载体,观察其对静脉移植血管血栓形成和新生内膜增生的影响.方法 建立大鼠颈静脉-动脉移植模型,通过Pluronic F-127质粒缓释系统在血管吻合完成后局部喷涂凝胶进行RNA干扰.实验分4组,每组30只SD大鼠,A组:对照组,空白Pluronic F-127凝胶；B组:SM22α组,含特异性SM22α启动子质粒的凝胶；C组:巨细胞病毒(CMV)组,含非特异性CMV启动子质粒的凝胶；D组:Wortmannin阳性对照组.分别于术后1、3、7、14、28 d截取移植血管,苏木素-伊红(HE)染色观察新生内膜厚度;免疫组织化学检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR,Ser2448),原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞捌亡.另设一平行实验组(12只SD大鼠),按上述方法分为4组,于术后3d取材,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(FQ-PCR)测定Pik3cb mRNA的相对表达量.结果 大体观察移植血管通畅率B组高(86.7％),与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)；Pik3cb mRNA相对表达量B、C、D组分别下降了73.3％、81.2％、68.4％,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)；术后1、3、7、14、28 d,B组与A组比较,磷酸化mTOR(Ser2448)阳性面积均显著降低,细胞凋亡阳性面积均显著增加,差异均有统计学意义(P＜0.05),术后7、14、28 d,B组与A组比较,血管内膜厚度显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 SM22α特异性启动子/增强子真核表达载体可通过下调血管平滑肌细胞磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B-mTOR(PI3 K-Akt-mTOR)信号通路而抑制其向内膜增殖、迁移,促进其凋亡,防止血管新生内膜增生,提高移植血管通畅率.
