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比较胚胎和新生小鼠肠神经嵴干细胞体外增殖分化的实验研究
目的 联合应用简化无血清培养基和连续传代法,从胚胎14～17 d、新生1 d、新生5 d小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells,GNCSCs),观察其体外培养过程中增殖、分化的特点,用p75、GFAP、Peripherin、α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系,比较胚胎和新生小鼠GNCSCs在生长速度、分化细胞的种类及数量上的差异.方法 取3组小鼠的肠管,分离制成单细胞悬液,接种于DMEM/F12完全培养基贴壁培养,在连续传代培养中观察克隆球的形成;将克隆球接种于含血清培养基,观察其分化现象;用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果 部分胚胎和新生小鼠肠管细胞在无血清培养基中连续传代培养形成克隆球.在血清刺激下克隆球可分化为多种形态的细胞.克隆球和分化细胞系的免疫染色均为阳性.结论 胚胎和新生鼠肠管内存在具有自我更新能力的GNCSCs,且均可分化为神经元、神经胶质细胞和平滑肌三类细胞.新生鼠较胎鼠GNCSCs生长速度慢,分化的神经元数量减少,神经胶质细胞数量增加,平滑肌细胞无显著变化.
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骨形态发生蛋白2对体外培养肠神经嵴干细胞的调控作用
目的 研究体外培养肠神经嵴干细胞(enteric neural crest stem cells,ENCSCs)的方法,以及骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2,BMP2)对ENCSCs增殖、迁移的作用,揭示BMP信号通路在先天性巨结肠发生、发展中的作用.方法 ①机械分离法和酶消化法从SD大鼠的胎鼠肠道组织获取ENCSCs,免疫荧光法鉴定干细胞特性和多向分化能力;②光镜计数法检测不同浓度BMP2,以及BMP2与胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)对ENCSCs增殖(成球率)的影响;③肠片三维立体培养观察BMP2及GDNF对ENCSCs迁移的影响.结果 ①成功从胎鼠肠道组织分离提取ENCSCs,于培养第8天可见神经球形成,并可反复传代培养;②将获得的ENCSCs反复传代后,采用免疫荧光检测其具有干细胞特性(P75 +/Nestin+)和多向分化能力[可以分化为成熟神经元(TUJ1+)、神经胶质细胞(GFAP+)和平滑肌细胞(αSMA+)],证实其为于细胞;③与对照组比较,BMP2可明显促进ENCSCs的增殖及迁移能力(P＜0.05),GDNF可以增强其生物学效应(P＜0.05).结论 ①成功获得ENCSCs,并证实其具干细胞干性和多向分化能力;②BMP2对ENCSCs的迁移、增殖具有明显的促进作用.
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新生大鼠肠神经嵴干细胞的体外培养和鉴定
目的 探索体外分离培养新生大鼠肠神经嵴干细胞(ENCSCs)的方法,观察肠神经嵴干细胞神经球(NLBs)的原代及分化情况.方法 取新生SD大鼠,无菌环境下解剖分离从小肠至直肠的肠管,胰酶消化成单细胞悬液后,接种于培养瓶行原代培养,并传代;传到第3代时,加入分化培养基进行分化培养.观察ENCSCs原代培养及分化培养的情况,免疫荧光染色观察NLBs巢蛋白(nestin)的表达以及分化后ENCSCsHuD蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果 ENCSCs原代培养第1天,可见细胞贴壁成长,第2天,贴壁细胞减少,出现大量悬浮的细胞团,第4天,悬浮细胞团增大,形成体积稍小的NLBs,7d后,大量NLBs漂浮于培养液中.未分化的NLBs行免疫荧光染色可见nestin阳性表达;NLBs分化后贴壁的细胞可见HuD、GFAP阳性表达.结论 新生大鼠肠道可提取出ENCSCs,培育出ENCSCs神经球,并能够分化成神经元和神经胶质细胞.
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肠神经嵴干细胞移植治疗巨结肠的研究现状
先天性巨结肠(Hirschsprung's disease,HD)是小儿常见疾病,发病率高达1/2000-1/5000,显著病理生理变化是病变肠管神经发育异常或确缺如,导致局部肠管痉挛和狭窄,肠蠕动丧失和内括约肌松弛反射消失,随着近端肠管的蠕动,不断推挤肠内容物向前,引起狭窄段近端肠管扩大,从而形成继发性巨结肠,是严重影响儿童健康的先天性疾病.目前,HD保守治疗效果差,多数需手术治疗,但各种手术并不能从根本上恢复所有肠道功能,均有相应缺陷和并发症[1],许多患儿术后肠道运动功能紊乱持续存在[2-3],术后并发症高达20％ ～ 30％.
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成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定
目的:利用简化无血清培养基和连续传代法,从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs),观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点.用p75, GFAP,Peripherin,α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系.方法:将新生1, 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液,接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养,连续传代培养并观察克隆球的形成过程.将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中,观察其分化现象.用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果:成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞.结论:成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs,在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.
关键词： 肠神经嵴干细胞 小鼠 细胞培养技术 细胞分化 Hirschsprung病 -
小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定
目的 建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells,GNCSCs)的方法,为临床应用奠定基础.方法 分离胚鼠肠管,消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基,贴壁培养;连续传代后用血清促进GNCSCs分化;后用免疫细胞化学方法染色鉴定.结果 分离培养的细胞聚集生长,形成的克隆球可以传代;克隆球p75染色阳性;分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原.结论 分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力,表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75,是肠神经嵴干细胞.
