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海藻酸钙胶原材料联合BMP2修复兔桡骨缺损的实验研究
目的 探讨海藻酸钙胶原材料联合BMP2植入动物体内的成骨能力.方法 4月龄健康新西兰大白兔18只,制备桡骨中段1.5 cm骨缺损模型.按随机数字表法将模型兔分为实验组和对照组,实验组兔桡骨缺损部位植入海藻酸钙及BMP2,对照组植入海藻酸钙,于术后4、8、12周分别处死每组3只动物,取出标本,行大体观察、X射线观察和组织学检测缺损部位的成骨情况.结果 4周时实验组中骨缺损区可见明显的骨生成影像,分布在骨缺损区的骨量随时间延长而增多.结论 BMP2能增强海藻酸钙胶原材料的成骨能力.
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不同治法方药对激素性股骨头坏死鸡成骨相关因子的影响
目的:通过观察健脾化痰、活血通络(健脾)与补肾壮骨、活血通络(补肾)2种不同治法方药对激素性股骨头坏死鸡成骨因子骨形成蛋白(BMP)2、转化生长因子(TGF)β1及其下游蛋白Smads的影响,比较探讨其防治股骨头坏死的作用机制.方法:48只来杭鸡经胸肌注射甲基氢化泼尼松建立激素性股骨头坏死模型后,随机分为模型组、健脾组和补肾组,另16只来杭鸡设为正常对照组,4个实验组在造模同时分别灌胃生理盐水和相应中药.给药8周和16周后取双侧股骨头,免疫组织化学法检测BMP2,TGFβ1和Smad4,7蛋白表达.结果:与正常组相比,模型组股骨头BMP2,TGFβ1和Smad4阳性细胞计数显著减少、Smad7明显增加;与模型组相比,健脾组8周时BMP2,TGFβ1和Smad4阳性细胞计数显著增多、Smad7明显减少,与补肾组在16周时的作用相类似.结论:健脾与补肾2种不同治法方药均能通过调节股骨头内成骨因子BMP2,TGFβ1和Smad4,7蛋白表达来促进股骨头的修复,防治股骨头坏死;健脾方药比补肾方药起效时间更早.
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补肾健脾活血方干预过表达DKK1骨细胞对细胞活性及BMP2的影响
目的 用补肾健脾活血方干预过表达的DKK1腺病毒转染的成骨细胞,通过观察细胞的活性及BMP2的表达,研究补肾健脾活血方治疗骨质疏松的分子生物学机制.方法 将培养细胞分成NC对照组,Ad-DKK1组两组.NC对照组由空载腺病毒转染;Ad-DKK-1组由包装过表达的DKK1腺病毒转染.每组分别用含药血清和空白血清干预.采用CKK-8检测细胞增殖,蛋白印记法检测BMP2的表达.结果 各组细胞活性变化;空白血清和含药血清干预均能提高细胞活性.与空白血清分别干预的两组比较,含药血清分别干预后的两组,在24 h,48 h,72 h的细胞活性的增加倍数都较多;在采用蛋白印记法检测后,BMP2在含药血清分别干预的两组的相对表达量较空白血清分别干预的两组的相对表达量高(P ＜0.01,P＜0.01),在NC对照组中含药血清干预与空白血清干预无明显差异.结论 补肾健脾活血方含药血清可以提高细胞活性,提高BMP2的相对表达量,有利于成骨细胞的矿化,尤其在过表达DKK1干预后.补肾健脾活血方可能通过调控DKK1进而影响成骨细胞的代谢.
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金匮肾气丸调控FNDC5、BMP2对BMSCs成骨分化的作用
目的 研究金匮肾气丸通过调控FNDC5、BMP2基因对BMSCs成骨分化的影响.方法 采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,分别用大鼠空白血清和高、低剂量金匮肾气丸干预BMSCs成骨分化过程.采用CCK8检测金匮肾气丸对BMSCs的增殖、毒性作用;AKP活性检测细胞上清成骨分化活性;ALP染色检测细胞成骨分化能力;反转录-实时荧光定量技术(RT-qPCR)检测FNDC5、BMP2 mRNA表达;Western-blotting检测FNDC5、BMP2蛋白表达.结果 CCK8结果示,从第1天到第7天,各组细胞增殖整体呈上升趋势,7天后各组细胞增殖呈下降趋势,且各组增殖(OD值)无统计学差异.含药血清干预BMSCs 3天时,SG组AKP活性明显高于CON(P ＜0.01),SD组与CON组差异虽无统计学意义,但高于CON组;7天时,SG和SD两组AKP活性均高于CON组(P＜0.05);ALP染色结果示:SG组和SD组ALP染色阳性率均高于CON组,而SG组ALP染色率高于SD组.干预3天时,SD组FNDC5 mRNA表达较CON、SG组显著上调(P＜0.05);7天时,SD、SG组FNDC5mRNA表达均较CON组显著上调(P＜0.05),SD组高于SG组(P＜0.05).3、7天时SG、SD组BMP2 mRNA表达均较CON组显著上调(P＜0.01).干预第3、7天时,SG、SD组FNDC5、BMP2蛋白水平均明显高于CON组(P＜0.05).结论 金匮肾气丸含药血清可能通过上调FNDC5、BMP2基因水平来促进BMSCs成骨增殖、分化.
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胶原支架负载BMP-2促进大鼠脊柱横突融合的临床观察
目的 探讨胶原支架负载骨形成蛋白2(BMP2)在脊柱横突融合中的应用价值.方法 将60只雄性SD大鼠随机分成3组,假手术组、材料组与复合材料组,各20只,行脊柱后外侧横突间融合手术,材料组和复合材料组大鼠 L4~5横突间分别植入胶原支架和胶原支架负载BMP2,未植入任何材料组为假手术组.术后8周予手触力学评定、X线评分、micro-CT扫描、H&E染色观察等分析和检测.结果 手触力学评定、X线评分、micro-CT扫描、H&E染色观察显示8周后材料组和复合材料组大鼠 L4~5横突间均有不同程度融合,假手术未见融合,且复合材料组融合效果优于单纯材料组.结论 胶原材料负载BMP2促进大鼠脊柱横突融合,具有潜在的临床应用价值.
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局部注射超声微泡促进BMP 2在大鼠体内骨骼肌表达的研究
目的 分析局部注射超声微泡对BMP 2在大鼠体内骨骼肌中表达的促进作用.方法 将30只大鼠平均分为1组(空白对照)、2组(直接注射质粒)、3组(注射质粒目的基因+微泡),并向三组大鼠股四头肌中注射造影剂、生理盐水和BNM 2-EGPF,每组再分为A、B组,于7d、14d分别处死大鼠,检测BMP 2的表达状况.结果 7d后,3组中A组大鼠的BMP2阳性表达率高于1组中A组大鼠和2组中A组大鼠(P＜0.05),14d后,3组中B组大鼠的BMP2阳性表达率高于1组中B组大鼠和2组中B组大鼠(P＜0.05).结论 局部注射超声微泡能够提高BMP2在大鼠骨骼肌中的表达含量,可为临床治疗骨折疾病提供新思路.
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消骨痛汤对骨关节炎大鼠 TGFβ1和 BMP2表达观察
目的：观察中药方剂消骨痛汤对骨关节炎（OA）大鼠模型中软骨和滑膜中转化生长因子β1（TGFβ1）和骨形成蛋白2（BMP2）的表达。方法将40只Wistar大鼠随机分为4组，每组10只。正常对照组不予干预，其余3组采用膝关节腔内注射木瓜蛋白酶的方法建立骨关节炎大鼠模型，造模2周后开始给药，分别给予生理盐水（模型组）、双氯芬酸钠（西药组）和中药消骨痛汤（中药组），灌胃8周后取软骨及滑膜标本。用免疫组化方法检测TGFβ1和BMP2在软骨和滑膜中的蛋白表达。结果模型组和西药组软骨、滑膜中TGFβ1、BMP2水平低于中药组和正常组，差异均有统计学意义（P＜0．05）。中药组和正常组TGFβ1和BMP2水平差异无统计学意义（P＞0．05）。结论消骨痛汤能上调OA大鼠软骨和滑膜中TGFβ1和BMP2的蛋白表达。
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大豆异黄酮与大鼠成骨细胞BMP2PCR产物表达
目的探讨大豆异黄酮对体外培养大鼠成骨细胞骨形态发生蛋白2(BMP2)表达的影响.方法制作新生大鼠颅骨成骨细胞体外培养模型,用不同浓度的大豆异黄酮刺激分离培养的大鼠成骨细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR扩增BMP2基因cDNA,同时扩增β-actin cDNA作为内对照,扫描RCR产物电泳照片,计算BMP-2/β-actin cDNA的积分吸光度比值,推算BMP2基因相对表达水平;并通过免疫组化方法观察成骨细胞BMP2的表达,用HPIAS-2000图象分析仪对各组表达进行定量分析.结果大豆异黄酮增加体外培养成骨细胞BMP2的水平,并且在基因转录水平促进大鼠成骨细胞BMP2表达,呈剂量-效应关系(P《0.01).结论大豆异黄酮对成骨细胞形成BMP2表达有显著促进作用.提示大豆异黄酮促进成骨细胞增殖、分化的作用可能与通过增加BMP2基因的表达有关.
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活血通络汤中药对激素性股骨头坏死造模家兔中BMP2和Jagged1表达的影响
目的:探讨中药预防性治疗激素性股骨头坏死(SANFH)的疗效及作用机制.方法:将192只日本大耳兔随机分为模型组A(48)、模型组B(48)、模型对照组c(48)、空白对照组D(48),A组第2周开始喂服中药饲料,B组第3周开始喂服中药饲料,C、D组均喂服等量普通饲料,A、B、C组第3周开始造模,每组分别于第2周末、第5周末、第8周末随机抽取8只取双侧股骨头标本,做病理镜检及计算空骨陷窝率,并采用酶联免疫吸附法(ELISA)对兔血清BMP2的含量进行测定,实时荧光定量PCR(RT-PCR)对兔血清Jagged1蛋白基因表达进行测定.结果:病理镜检及空骨陷窝率显示造模成功,BMP2阳性表达的强度及面积均明显高于造模组,结果有统计学意义(P＜0.05),模型组A、模型组B、模型对照组C的Jagged1均呈上调趋势.结论:①表明活血通络汤中药对股骨头坏死的预防治疗作用确切;②活血通络汤中药可能是通过促进Jagged1的上调并维持股骨头BMP2浓度,共同促进骨修复和血管生成起治疗作用.
关键词： 激素性股骨头缺血性坏死 BMP2 Jagged1 活血通络汤 -
基因重叠延伸拼接PCR法钩建骨形态发生蛋白成熟肽真核表达载体的研究
Objective To construct an eukaryote expression vector containing bone morphogenetic protein 2 (BMP 2) mature peptide. Methods Gene splicing by overlapping extension PCR (SOE PCR) method was used to clone BMP2 signal peptide and mature peptide and their fusion fragment.The fusion fragment was cloned into an eukaryote expressing vector pcDNA3.1/myc His(- )A. The sequence of the fusion fragment of BMP2 signal peptide and mature peptide was identified.Results The sequence of the fusion fragment was correct comparing with BMP2 signal peptide and mature peptide published by NCBI.Conclusion The vector pcDNA3.1/myc His(- )A BMP2sm constructed in this experiment was suitable to applying in eukaryotic expression of BMP2.
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骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力
背景:应用骨形态发生蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)双基因转染骨髓基质干细胞诱导成骨,为组织工程骨的研究提供实验基础.目的:探讨BMP2和VEGF165双基因转染大鼠骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力.方法:4周龄SD大鼠4只,取股骨、胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,取第3代骨髓基质干细胞分为5组,分别为未转染组、空载质粒组、BMP2单基因转染组、VEGF165单基因转染组、BMP2和VEGF165双基因共转染组,转染后48 h通过Western Blot检测BMP2和VEGF165蛋白表达变化,转染后7d检测各组细胞的碱性磷酸酶活性.结果与结论:①BMP2和VEGF165双基因共转染组和BMP2单基因转染组中有大量的BMP2分泌.BMP2和VEGF165双基因共转染组和VEGF165单基因转染组中有大量的VEGF165分泌.双基因共转染组中BMP2和VEGF165蛋白水平与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);②BMP2和VEGF165双基因共转染组中碱性磷酸酶活性高,其次是BMP2单基因转染组,而VEGF165单基因转染组明显不如前两组,但是略高于空质粒转染组和未转染组.统计分析表明双基因共转染组与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,BMP2和VEGF165双基因转染促进骨髓基质干细胞异位成骨的能力更强.
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麦胚提取物对去卵巢大鼠无机盐和骨形成蛋白2的影响
目的探讨麦胚提取物对去卵巢引起骨质疏松大鼠无机盐和骨形成蛋白2(BMP2)的影响.方法 21只雌性SD大鼠随机分为假手术组、去卵巢模型组、去卵巢加麦胚提取物组(麦胚提取物100 mg/kg·d),10 w后测定血清无机盐钙、磷、钠、钾、ALP含量,用SP免疫组织化学检测骨BMP2表达.结果去卵巢组大鼠试验10 w后血清和尿钙、钠和血清ALP含量显著升高;而血清和尿钾降低,骨BMP2表达下降(P<0.05或P<0.01).去卵巢加麦胚后大鼠的尿钙、钠和血清ALP含量显著降低,骨BMP2表达增高(P<0.05).结论麦胚提取物可调节去卵巢大鼠血清和尿中钙、钠、钾,促进BMP2表达,预防去卵巢大鼠骨质疏松.
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单纯性先天缺牙患者BMP2/BMP4基因位点分析
目的:对BMP2/BMP4基因在单纯性先天缺牙患者中的基因表达进行观察,探讨其在先天缺牙疾病中可能的发病机制.方法:提取单纯性先天缺牙患者40例及其家系成员外周静脉血基因组DNA,另选择100例非先天缺牙患者作为对照,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增BMP2/BMP4基因编码外显子,纯化、测序,应用DNASTAR软件对测序结果进行对比分析.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学处理.结果:40例先天缺牙患者中,共检测到BMP2/BMP4基因5个突变位点,其中BMP2基因4个突变点:3个错义突变c.109T＞G,c.166C ＞G,c.570A ＞T,检出率分别为7.5％、2.5％和95％;1个同义突变(c.261A＞G),检出率为100％.3个为dbSNP数据库中已报道过的多态位点:BMP2SNPs c.109T＞G p.Ser37Ala; c.261A＞G p.Ser87Ser; c.570A＞T p.Arg190Ser;家系先证者BMP2 c.166C＞G突变在正常对照组未检出,dbSNP数据库未报道,也未被收录于致病基因数据库,为新突变位点.BMP4基因检测出错义突变c.455T＞C,检出率为55％,为dbSNP数据库中已报道过的多态位点.与对照组等位基因及基因型比较,无显著差异.结论:单纯性先天缺牙可能与BMP2/BMP4基因检出SNPs相关.BMP2c.166C＞G杂合突变是新发现的突变,可能是单纯性先天缺牙家系的致病突变.
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黄芩素对人牙周膜细胞增殖、RUNX2和BMP 2表达的研究
目的：探讨中药黄芩提取物黄芩素对人牙周膜细胞（ hPDLCs）增殖和成骨基因RUNX2、BMP2表达的影响。方法原代培养hPDLCs，hPDLCs中分别加入浓度为1．25、2．50、5．00、10．00μmol／L的黄芩素作为实验组，空白组不加黄芩素。 MTT法检测黄芩素对hPDLCs增殖的影响；试剂盒检测ALP的活性和表达；qRT?PCR研究黄芩素对hPDLCs RUNX2、BMP2表达的影响。结果较空白组，1．25～10．00μmol／L黄芩素作用于hPDLCs，其增殖活力略下降，但差异无统计学意义（ P＞0．05）；黄芩素组ALP活性和表达上升（ P＜0．05），呈浓度依赖性；成骨相关基因RUNX2、BMP2 mRNA表达水平随时间延长，表达量持续上升，11 d上升为显著（ P＜0．05），且10．00μmol／L黄芩素组显著高于其余浓度组（ P＜0．05）。结论黄芩素对hPDLCs骨向分化有促进作用，有可能作为牙周再生的选择之一。
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BMP2转基因载体的构建及在大肠杆菌DH-5α中的诱导表达
BMP2基因来源于pSP6-BMP2质粒,用pcDNA3作载体,构建BMP2转基因载体并在大肠杆菌DH-5α中的诱导表达.用HindⅢ与XbaI双酶切pSP6-BMP2与pcDNA3质粒,回收BMP2基因片段与pcDNA3载体,用连接酶连接后转化JM109,提质粒后酶切鉴定;把构建好的载体转化DH-5α细菌,并诱导表达,用SDS-PAGE电泳鉴定有无表达,用WesternBlot鉴定表达蛋白.pcDNA3-BMP2载体酶切鉴定与预期片段相符,SDS-PAGE显示有BMP2蛋白表达;Western Blot证明表达蛋白有免疫原活性.成功地构建了表明pcDNA3-BMP2转基因载体并在大肠杆菌DH-5α中诱导表达了BMP蛋白.
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心肌微环境中Wnt11与BMP2协同作用促大鼠BM-MSCs分化为心肌样细胞的实验研究
目的 探讨在心肌微环境的旁分泌作用中,Wnt11与BMP2对促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)分化为心肌样细胞的协同作用.方法 建立Transwell共培养模型,将心肌细胞及转染Wnt11质粒的3T3细胞置于上层、BM-MSCs置于下层培养,前3天应用含50 μg/L Noggin(BMP抑制剂)培养液、第4天换用含0.5 μg/L BMP2的培养基诱导培养至第14天.根据不同诱导条件,培养细胞分为7组:阳性对照组(Heart组)、CM组、CM +BMP2组、CM+Wnt11组、Wnt11+BMP2组、CM+Wnt11+BMP2组、阴性对照组(BM-MSCs组).诱导培养结束后,采用RT-PCR方法,检测心肌特异性转录因子(Nkx2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌细胞特异性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)mRNA表达水平.结果 RT-PCR结果显示,在心肌细胞旁分泌微环境下,Wnt11与BMP2协同作用组(CM+Wnt11+BMP2组)心肌特异性转录因子和成熟心肌细胞特异性基因的表达明显高于阴性对照组和其他共培养对照组,低于阳性对照组(P<0.05).结论 在心肌细胞旁分泌微环境中,Wnt11协同BMP2表达可提高BM-MSCs向心肌样细胞分化的效率.
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BMP2和TGFβ3双基因真核表达载体的构建
[目的]构建骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体.[方法]从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以pGEMT/BMP2和反转录的cDNA为模板,PCR扩增出BMP2和TGFβ3两个基因全长,将两个基因片段分别定向连入双基因真核表达载体pIRES;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定.[结果]酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确.[结论]成功构建pIRESBMP2/TGFβ3双基因真核表达载体.
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双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究
[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况.[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组).运用Lipo-fectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原蛋白表达含量并测定灰度值.ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数.[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、Ⅰ型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、Ⅰ型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组.[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用.
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骨形成蛋白2活性多肽/Ⅰ型胶原复合煅烧骨修复兔桡骨缺损
目的 观察自行研制合成的骨形成蛋白2(BMP2)活性多肽与Ⅰ型胶原复合煅烧骨复合材料修复骨缺损的作用.方法 实验分3组.A组:单纯煅烧骨组;B组:含Ⅰ型胶原的煅烧骨组;C组:BMP2活性多肽与Ⅰ型胶原复合煅烧骨组.3组材料植入前分别电镜扫描观察.取大白兔36只,随机分成3组,建立桡骨中段10 mm骨缺损模型,分别将材料植入兔桡骨缺损处,术后4、8、12周行X线评分,8、12周行组织形态学观察与评分,比较各组植入材料的成骨作用以及取材后抗折强度.结果 36只大白兔均进入结果分析,(1)复合材料电镜扫描结果:孔隙率高,复合结构紧密;(2)术后不同时间X线评分示C组与A组和B组差异有统计学意义(P＜0.05);(3)组织学观察,8周时评分为:A组4.67±0.52、B组5.33±0.52、C组6.83±0.41.12周评分为:A组评分为6.17±0.41、B组为7.33±0.52、C组为8.67±0.52;(4)各组植入材料抗折强度的测定:术后12周,C组材料抗折强度明显高于A组和B组.结论 单纯煅烧骨及复合材料组均有修复骨缺损的能力,但以复合BMP2活性多肽的含I型胶原的煅烧骨较为理想.
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不对称性颌间牵引作用下BMP2在成年SD大鼠髁突关节下骨中的表达
目的:通过观察不对称牵引引起的成年大鼠髁突关节下骨中与骨改建密切相关的BMP2的表达情况,了解关节下骨对不对称机械应力的反应.方法:选用10周龄雄性SD大鼠220只(分轻力组104只、重力组104只、对照组12只),实验组动物使用关节外固定加力装置,分别施加0.39N、1.18N(轻力组和重力组),加力第28天拆除加力装置.在加力后3、7、14、28 d以及停止牵引后3、7、14、28 d分别取得左右侧标本,进行免疫组织化学染色,对结果进行计算机辅助的半定量分析.结果:正常的关节下骨也有BMP2的表达,内源性BMP2的表达增加与机械应力有关,BMP2表达的量受到力量的大小的影响.结论:BMP2参与不对称牵引引起的重塑过程.
