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黄连素调节BMP4转录通路基因表达改善2型糖尿病地鼠内脏白色脂肪组织胰岛素抵抗的研究
研究黄连素对2型糖尿病地鼠内脏白色脂肪组织(VWAT)中BMP4转录通路和白/棕脂组织转换通路基因mRNA表达的影响并探讨相关机制.应用高脂饮食诱导肥胖胰岛素抵抗地鼠模型,给予小剂量链脲菌素建立2型糖尿病地鼠模型.造模结束后随机分成正常对照组、肥胖胰岛素抵抗组、2型糖尿病组和2型糖尿病黄连素治疗组.治疗9周后,应用实时定量PCR方法检测各组地鼠VWAT中BMP4通路、白/棕脂组织转换通路及靶基因的mRNA表达改变.结果显示,模型地鼠VWAT中BMP4,BMPRⅡ,BMPRlA,Smad1,Smad5,Smad8,p38/MAPK,ATF2,PRDM16,C/EBPβ,PGC1α,PPARγ及棕脂组织特异基因的mRNA表达降低,而Smad6,Smurf1和白脂组织特异基因的mRNA表达增加.黄连素治疗调节VWAT中BMP4转录通路和棕脂组织转录通路,诱导棕脂组织特异基因mRNA的表达,诱导白色脂肪棕色化基因表型,改善脂诱性胰岛素抵抗.结果表明,BMP4转录通路参与脂诱性内脏白色脂肪组织胰岛素抵抗(FIVWATIR)的形成及黄连素诱导白色脂肪棕色化的分子机制.
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过表达骨形成发生蛋白4降低人胶质母细胞瘤系U251的侵袭
目的 探讨骨形成发生蛋白4(BMP4)对人胶质母细胞瘤细胞(U251)侵袭的影响.方法 通过转染过表达BMP4的质粒及敲低BMP4的siRNA,将U251细胞分为myc组、myc-BMP4组、siCtrl组、siBMP4组;用划痕实验、荧光定量PCR与免疫印迹技术,检测高/低表达BMP4后,细胞侵袭E-cadherin及Snail1 mRNA和蛋白表达.结果 过表达BMP4降低细胞侵袭(P<0.01),低表达BMP4增加细胞侵袭.过表达BMP4后,Snail1信号通路靶基因E-cad-herin表达量明显升高(P<0.01);低表达BMP4后,E-cadherin表达量明显降低(P<0.01);过表达BMP4时,Snail1表达量明显降低(P<0.01).结论 BMP4可以通过负性调节Snail1信号通路调节细胞侵袭.
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BMP4-siRNA重组腺病毒的构建及鉴定
目的 构建靶向抑制骨形态发生蛋白BMP4基因RNA的siRNA腺病毒,为进一步研究其在乳腺癌骨转移中的作用打下基础.方法 以PCR扩增获得BMP4全长片段,插入筛选质粒pSOS载体,同时设计6段靶向BMP4基因RNA的干扰片段,分别经酶切、连接及鉴定后获得pSOS-sirBMP4.脂质体转染293细胞,根据荧光表达量筛选获得干扰效率较高的4个干扰片段,插入穿梭质粒pSES-HUS,经重组、HEK-293细胞包装获得BMP4-siRNA腺病毒.感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,RT-PCR、Western blot检测其干扰效率.MTr法检测其对MDA-MB-231细胞增殖的影响.结果 筛选获得4个干扰效率较高的片段,插入穿梭质粒,经重组、包装获得腺病毒pAd-sirBMP4.感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231后,明显抑制BMP4的表达并促进MDA-MB-231细胞增殖.结论 成功构建具有较高干扰效率的腺病毒pAd-sirBMP4,为进一步研究BMP4在乳腺癌中的作用打下基础.
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鸡胚Bmp4和Cath1原位杂交RNA探针的制备
目的介绍一种鸡胚原位杂交探针制备方法。方法携带Bmp4和Cath1基因特异片段的质粒载体，通过质粒小提试剂盒扩增，限制性内切酶线性化，酚氯仿抽提纯化， T3 RNA聚合酶体外转录，合成地高辛标记的反义探针，通过电泳及鸡胚原位杂交检测探针的质量。结果获得了效果良好的Bmp4和Cath1的RNA探针。结论用质粒小提试剂盒对质粒载体扩增，进而通过线性化、纯化、转录等步骤来制备原位杂交探针的方法，具有时间短、费用低、质量高、杂交效果好等优点。
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整体鸡胚原位杂交体系的建立与优化
目的：建立并优化整体鸡胚原位杂交的实验方法，降低背景，提高信号强度，为后续实验提供良好条件。方法通过对整体鸡胚Bmp4（bone morphogenetic protein 4，骨形态蛋白）基因的原位杂交，摸索实验过程中起决定作用的影响因素及其佳工作状态。结果在整体鸡胚Bmp4原位杂交均获得高特异性和高强度的杂交信号，且背景色低。结论成功建立并优化了整体鸡胚原位杂交体系。
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脂多糖诱导食管鳞状上皮细胞表达BMP4的研究
目的:探讨脂多糖对食管鳞状上皮细胞的骨形态蛋白4(BMP4)表达的影响.方法:体外培养正常食管鳞状上皮Het-1A细胞,采用不同浓度脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理细胞、实时荧光定量PCR与蛋白印迹分析方法测定BMP4及Smad1表达的变化,并对其进行相关性分析.结果:10 ng/mL LPS组可轻微刺激食管鳞状上皮细胞表达BMP4、Smad1的表达,与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);100 ng/mL LPS组和500 ng/mL LPS组均明显增强BMP4和Smad1的表达,且随浓度增强效应增强,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:脂多糖可能通过诱导BMP4及BMP信号通路相关蛋白Smad1的表达参与Barrett食管的发生.
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BMP4通过诱导EMT促进肝癌迁移侵袭
目的：检测BMP4在肝癌中的表达并探讨BMP4在诱导肝癌EMT中的作用，进而研究其对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响。方法：采用免疫组织化学方法检测肝癌组织中BMP4的表达，分析其与肝癌临床病理资料之间的关系。将BMP4表达质粒转染至肝癌细胞系HepG2中，诱导BMP4外源性过表达。观察BMP4转染前、后HepG2的细胞形态学改变；Western blot检测转染前、后HepG2中BMP4、EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin）表达变化情况；划痕和侵袭实验检测BMP4对细胞迁移侵袭能力的影响。结果：BMP4与患者的年龄、病理分级、临床分期、不良预后密切相关。BMP4过表达后HepG2呈现典型的EMT形态学改变， E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调、细胞的迁移侵袭能力显著增强。结论：BMP4与肝癌临床病理资料密切相关，并可能通过诱导EMT促进肝癌细胞的迁移侵袭能力。
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戊四氮点燃过程中大鼠海马 BMP4表达与神经增殖关系
目的 探讨戊四氮(PTZ)点燃过程中大鼠海马骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)的表达变化与神经增殖的关系.方法 将成年大鼠分为对照组与模型组,模型组大鼠又根据在点燃中的不同时相点分为9组.用免疫组织化学与原位杂交的方法检测海马齿状回BMP4 mRNA与BrdU阳性细胞数的变化.结果 正常成年大鼠BMP4阳性细胞主要分布于齿状回的门区、颗粒下层、CA3、CA1区.BrdU阳性细胞主要分布在齿状回颗粒下层.BMP4阳性细胞与BrdU阳性细胞在点燃过程中均明显增加,呈明显正相关,点燃后2月降至基线水平.结论 BMP4可能通过影响成年大鼠海马神经发生在PTZ点燃过程中起重要作用.
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侧脑室注射BMP4诱导大鼠脑巢蛋白的表达
目的:探讨侧脑室注射BMP4后大鼠脑巢蛋白(Nestin)的表达情况.方法:成年SD大鼠侧脑室注射BMP 410 μg/μl,分别于术后1、3、7和14 d处死动物.应用Nestin免疫组织化学方法观察Nestin的表达.结果:BMP4组的大鼠皮质、纹状体、室管膜下区Nestin阳性细胞在3 d开始出现,到7 d达到高峰,然后逐渐减少,非注射侧的Nestin阳性细胞数均较注射侧少;与对照组,差别有显著性.结论:BMP4可诱导和增强脑Nestin表达.
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Shh、Bmp4及Bmp7与前列腺增生的分子生物学研究
良性前列腺增生症(benign prostate hyperplasia,BPH)是老年人常见的疾病之一.顾方六等在1995年调查了北京40岁以上城乡居民419人前列腺增生的发病率,40岁～为10.2%、50岁～为17.8%、70岁以上达50.0%[1].上海仁济医院在90年代中期对上海市1582例40岁以上男性前列腺增生的调查发现,40岁～的发病率为15.3%,而50岁～则升高到34.8%,70岁以上将近50%[2].前列腺增生导致的尿频、尿急,夜尿增多等临床症状严重影响了老年人的生活质量.目前,BPH的发病机制尚未完全阐明,其中激素内分泌学说、上皮-间质细胞相互作用学说等曾被研究.现今主要的研究热点集中在分子生物学基因调控方面,以下就目前良性前列腺增生与一些生长因子的研究作一综述.
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单纯性先天缺牙患者BMP2/BMP4基因位点分析
目的:对BMP2/BMP4基因在单纯性先天缺牙患者中的基因表达进行观察,探讨其在先天缺牙疾病中可能的发病机制.方法:提取单纯性先天缺牙患者40例及其家系成员外周静脉血基因组DNA,另选择100例非先天缺牙患者作为对照,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增BMP2/BMP4基因编码外显子,纯化、测序,应用DNASTAR软件对测序结果进行对比分析.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学处理.结果:40例先天缺牙患者中,共检测到BMP2/BMP4基因5个突变位点,其中BMP2基因4个突变点:3个错义突变c.109T＞G,c.166C ＞G,c.570A ＞T,检出率分别为7.5％、2.5％和95％;1个同义突变(c.261A＞G),检出率为100％.3个为dbSNP数据库中已报道过的多态位点:BMP2SNPs c.109T＞G p.Ser37Ala; c.261A＞G p.Ser87Ser; c.570A＞T p.Arg190Ser;家系先证者BMP2 c.166C＞G突变在正常对照组未检出,dbSNP数据库未报道,也未被收录于致病基因数据库,为新突变位点.BMP4基因检测出错义突变c.455T＞C,检出率为55％,为dbSNP数据库中已报道过的多态位点.与对照组等位基因及基因型比较,无显著差异.结论:单纯性先天缺牙可能与BMP2/BMP4基因检出SNPs相关.BMP2c.166C＞G杂合突变是新发现的突变,可能是单纯性先天缺牙家系的致病突变.
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巢蛋白在P19神经元分化过程中的表达
小鼠巢蛋白(nestin)基因编码了一个中等纤维骨架蛋白,该基因在小鼠中枢神经系统发育过程中瞬时性表达.为了推测该基因在神经发育过程中可能的功能,我们分析了该基因在RA诱导的P19胚胎性癌细胞体外神经分化过程中的表达规律.结果显示,在上述过程中,巢蛋白基因的表达早于神经前体细胞(neural precursor cell)中表达的BMP4,以及在成熟神经元中特异表达的标记分子神经丝(NF160),表明巢蛋白基因可能主要在神经干细胞(neural progenitor cell)阶段表达.细胞免疫染色结果显示,巢蛋白在神经突及生长锥上存在较强的分布,表明它可能参与了有丝分裂后神经元与靶细胞之间神经联系的建立.
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跨胎盘RNAi技术对目的基因下调的研究
目的：利用跨胎盘RNA干扰技术下调目的基因，研究小鼠胚胎发育中BMP4基因的功能。方法实验分为Ringer’ s液空白对照组（空白组）、 pSES阴性对照组（阴性组）、 pSES?SiBMP4实验组（实验组），各组孕7．5 d母鼠尾静脉注射干预。分别对干预溶液体积、质粒浓度、注射速度进行研究。[依据小鼠克数体重体积分别采用5、10、15及20μl／g；浓度采用10、30、50及70 ng／μl；注射时间3、5、10、20及30 s。]探索获得基因下调胚胎鼠的适参数，并观察干预48 h后胚胎基因型及表现型。结果实验组孕鼠在10μl／g，50 ng／μl，5 s给药后荧光强度下调明显，与阴性组、空白组比较干预48 h后胚胎存在中枢神经系统、心血管系统异常，实验组胚胎 BMP4及 Smad4基因 mRNA 下调。结论优化的跨胎盘RNAi技术可用于小鼠基因功能的研究。
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大鼠骨形成蛋白4基因重组腺病毒的构建
目的利用Cre-loxP特异性位点基因重组技术构建大鼠骨形成蛋白BMP4的重组腺病毒.方法高保真PCR得到大鼠BMP4 cDNA,克隆到质粒pCR-Blunt Ⅱ-TOPO中,然后将目的基因片段连接到中间载体质粒pDNR-CMV,测序后在Cre重组酶作用下,将BMP4 cDNA转移到腺病毒载体pLP-Ade-no-X-CMV.在HEK 293细胞中扩增重组腺病毒,并检测BMP4基因重组腺病毒在细胞中的表达和功能.结果PCR法和限制性内切酶Xhol I消化法均证实BMP4重组腺病毒的成功构建,RT-PCR和Western Blot检测证实该重组腺病毒显著性增强了CFSC-2G细胞中BMP4的mRNA和蛋白表达水平.结论Cre-loxP特异性位点基因重组技术是一种快速、高效构建基因重组腺病毒的方法,大鼠BMP4基因重组腺病毒的成功构建为进一步研究BMP4的细胞调控功能和BMP4基因治疗提供了良好的工具.
关键词： Cre-loxP特异性位点基因重组 BMP4 基因重组腺病毒 -
视神经损伤后上丘BMP4 mRNA与Noggin mRNA表达的变化
目的 探讨大鼠视神经损伤后上丘BMP4 mRNA与Noggin mRNA的表达变化.方法 采用单侧眼球摘除的视神经损伤动物模型,将大鼠分成正常对照组、眼球摘除后24 h、1周、2周、3周组,原位杂交检测对侧上丘BMP4 mRNA与Noggin mRNA的表达变化,免疫组化检测MAP2和GFAP阳性细胞数量和形态的变化.结果 BMP4 mRNA在损伤后24 h显著升高(P＜0.01),1周组的表达较24 h降低;Noggin mRNA在损伤后各组的表达水平与正常对照组相比无明显变化(P＞0.05).GFAP阳性细胞在损伤后24 h即明显增加(P＜0.01),MAP2阳性细胞在损伤后1周数量减少(P＜0.01).结论 单侧眼球摘除后大鼠对侧上丘BMP4 mRNA与Noggin mRNA的表达水平可能是导致损伤后星形胶质细胞反应性增生和神经元退行性死亡的因素之一.
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PTZ点燃癫痫大鼠海马NSE和BMP4的表达
目的 观察神经元特异性烯醇酶(neuron-specific enolase, NSE)和骨形成蛋白4(bone morphogenic protein 4, BMP4)基因在戊四氮(pentylenetetrazol, PTZ)点燃癫痫大鼠海马中的表达,并探讨两者与癫痫发病机制和脑损伤的关系.方法 将50只成年雄性SD大鼠分为对照组和实验组.实验组采用PTZ点燃癫痫大鼠,按点燃进程,又随机分为Ⅰ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组和Ⅴ级组.用免疫组化技术、地高辛标记特异性寡核苷酸探针原位杂交组织化学技术和图像分析技术,观察海马NSE和 BMP4表达的变化.结果 发现应用PTZ点燃后,随发作级别的增高,大鼠海马各区NSE和BMP4的表达亦增加.在Ⅲ和Ⅳ级大鼠海马CA3及DG的NSE和BMP4表达明显高于对照组(P＜0.01);Ⅴ级大鼠在发作后海马CA3及DG的NSE和BMP4表达呈逐渐下降.结论 PTZ点燃可诱导癫痫海马内神经元损伤和神经发生增加,这可能是癫痫海马内神经元丢失、神经元可塑性的病理基础;NSE其表达水平与神经元损伤程度和预后密切相关;BMP4可能在PTZ癫痫形成过程中起重要作用.
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脑室内注射对β-淀粉样蛋白大鼠海马BMP4和nestin表达的研究
目的 通过侧脑室注射β-淀粉样蛋白(Aβ)后检测大鼠海马骨形成蛋白-4(BMP4)和巢蛋白(nestin)的表达,观察Aβ注射后局部神经干细胞(NSCs)的发生以及星型胶质细胞的活化增生情况.方法 将Aβ1-42注射入大鼠侧脑室,分别于术后3、7、14、30d处死动物,应用免疫组化法观察BMP4的表达,用免疫荧光方法观察nestin,GFAP的表达,Brdu标记判断增殖细胞的种类.结果 实验组的大鼠海马BMP4阳性细胞在3d已出现,到7d达到高峰,然后略微减少,维持在较高水平;而nestin阳性细胞也在3d已出现,到14d达到高峰,30d仍有表达,表达nestin的细胞主要为星形胶质细胞,部分活化星型胶质细胞来源于NSCs;对照组仅有极少数散在阳性细胞.结论 β-淀粉样蛋白脑室注射后大鼠海马nestin表达增加,星型胶质细胞活化增生,BMP4可能促进了海马区NSCs向胶质细胞分化.
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PTZ点燃癫痫大鼠海马BMP4的表达研究
目的 观察骨形成蛋白4(BMP4)基因在戊四氯(PTZ)点燃癫痫大鼠海马中的表达,并探讨其与癫痫发病机制的关系.方法 将40只成年雄性SD大鼠随机分为对照组和实验组.实验组采用PTZ点燃癫痫大鼠,按点燃进程,又随机分为Ⅰ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组和Ⅴ级组.用地高辛标记特异性寡核苷酸探针原位杂交组织化学技术和图像分析技术,观察海马BMP4表达的变化.结果 发现应用PTZ点燃后,Ⅱ级以上大鼠海马区BMP4的表达增加.Ⅲ和Ⅳ级大鼠海马CA3及DG BMP4的表达明显高于对照组(P＜0.01);Ⅴ级大鼠在发作后海马CA3及DG BMP4的表达呈逐渐下降.结论 BMP4可能参与了癫痫的发生、发展过程.
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bmp3、bmp4、bmp7在犬牙根发育过程中的表达研究
目的:探讨bmp3、bmp4、bmp7在牙根发育过程中的生理作用.方法: 采用原位杂交染色技术,观测犬恒牙牙根发育各阶段标本中bmp3、bmp4、bmp 7mRNA的定位表达.结果:bmp3的表达始于牙根发育早期的牙囊组织,之后转移到成牙骨质细胞和牙周膜细胞中;bmp4阳性信号在发育过程中主要位于成牙本质细胞层中;bmp7在牙根发育早期的颈环处上皮根鞘细胞有表达,而后还在分泌期的成牙骨质细胞和成牙本质细胞中表达.结论:bmp3、bmp4、bmp7在牙根发育过程中的表达具有时空特异性,提示它们参与调控牙根的发育.
