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豚鼠耳蜗部分外支持细胞的分离法
目的:探讨豚鼠耳蜗部分外支持细胞(Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞)的分离方法,并建立细胞活性的鉴别标准. 方法:选取健康杂色豚鼠5只,解剖出耳蜗基底膜,采用酶解加机械吹打法分离Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞.结果:可以获得较多数量、活性良好、长短不一的Deiter细胞和Hensen细胞,8 h内细胞活性较好;但外柱细胞数量较少,存活时间较短.评价Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性标准:①细胞膜无膨胀或扭曲;②细胞核无肿胀、移位;③在相差显微镜下细胞呈半透明状态,存在双折射现象;④细胞内无呈布朗运动的颗粒.结论:熟悉耳蜗的解剖特性、分离出完整的基底膜,增加酶的浓度和加大机械吹打力度是获取活性良好的Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的关键;评价外毛细胞活性的4项标准同样可用于判断Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性.
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豚鼠耳蜗Hensen细胞脂滴的性质与分布
目的：探索豚鼠内耳Hensen细胞（Hensen cells ，HC）中透明物质的性质及分布。方法10只豚鼠分离制备好耳蜗单离 Hensen细胞后，采用中性脂滴的特异分子探针Bodipy 493／503、苏丹Ⅲ、油红O染色及锇酸再固定四种染色方法对内耳组织进行染色，观察耳蜗不同区域 Hensen细胞中脂滴的分布情况。结果豚鼠耳蜗不同区域Hensen细胞内均存在高透亮物质，从顶回至底回其体积逐渐变小，数量逐渐增加，至底回逐渐消失；该物质经Bodipy 493／503分子探针特异标记为绿色，被苏丹Ⅲ染色为橘红色，被油红 O染色为宝石红，被锇酸后固定后呈黑色颗粒，证实为脂滴。结论四种染色方法对内耳组织的染色结果均提示内耳 Hensen细胞中透明物质为脂类物质。
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豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的分离技术及其钾通道
目的探讨适合膜片钳技术的单离Hensen细胞的分离及对其钾通道的研究.方法取豚鼠耳蜗,获得Corti器,采用酶消化和机械分离方法对Hensen细胞进行分离,并采用传统全细胞膜片钳技术,记录单离Hensen细胞的钟电流.结果每只耳蜗可以获得活性良好的单离Hensen细胞12±3个.Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性,只有迟电流(IK),没有峰电流(IA).结论酶消化结合机械分离的方法可获得适用于膜片钳技术研究的单离Hensen细胞,并用于讨论了所记录到的Hensen细胞钾电流.
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豚鼠柯替氏器支持细胞的分离和鉴定
目的建立豚鼠柯替氏器支持细胞的分离方法,并观察活性支持细胞的形态特征.方法对豚鼠基底膜用Ⅳ型胶原酶(1 mg/ml)消化和微机械分离法获得柯替氏器单离支持细胞,在倒置显微镜下观察细胞的活性和形态特征并记数.结果不同支持细胞在倒置显微镜下各有其形态特征,第一、二排Deiters细胞为逗点状,第三排为弓状;Hensen细胞为长圆形,半透明的胞质内含有数个脂质样颗粒;外柱细胞呈哑铃状,两端对称性圆球形,中间可见清晰的微管;内柱细胞呈"长勺形",底部为圆球状,顶部逐渐向外侧弯曲成杯口样结构.每个豚鼠耳蜗可分离出单离Deiters细胞1～4个,Hensen细胞10～20个,内柱细胞和外柱细胞分别约80～100个.结论Ⅳ型胶原酶消化和微机械分离法可分离出豚鼠柯替氏器的Deiters细胞、Hensen细胞和内、外柱细胞,可为在细胞和分子水平对单离活性支持细胞进行形态和功能变化的研究提供一种简便实用的方法.
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豚鼠耳蜗Hensen细胞的分离、活性鉴定及其胞内静态游离Ca2+分布
使用酶消化法及机械分离法对Hensen细胞进行分离,置于倒置显微镜下用碘化丙啶及钙敏荧光染料Fluo-3进行细胞活性鉴定并在激光扫描共聚焦显微镜下观察静息状态Hensen细胞内的游离Ca2+的时空分布.结果证明,每个豚鼠耳蜗可以得到单离的Hensen细胞5～12个.细胞活性良好,可保持5～6 h.当细胞变性、坏死时可见一系列的形态学变化.对此得出几点判断Hensen细胞活性的标准:(1)细胞体呈卵圆形或椭圆形,大小可不一致;(2)细胞膜完整,细胞边界清楚,折光现象明显;(3)细胞浆清澈透明,无布朗运动,无溢出;(4)细胞浆内的脂滴清晰可辨,折光现象明显;(5)细胞无水肿(即无气球样变).在静息状态下,Hensen细胞内的Ca2+在细胞内分布不均匀,脂滴所在部位没有Ca2+的分布.随时间延长,细胞内的[Ca2+]i可小幅度振荡,但基本处于一种稳定状态.本工作为进一步对Hensen细胞的其他特性进行研究打下了基础.
