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AAV2介导ND4基因治疗LHON不同免疫抑制方案的比较研究
目的 玻璃体腔注射重组ND4基因的腺相关病毒血清型2(Adenovirus associated virus 2 -NADH dehydrogenase subunit 4,AAV2-ND4)是Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)的基因治疗方法,观察基因治疗后不同免疫抑制方案组全身免疫抑制效果及ND4基因表达情况.方法 各实验组(A~D组)均单次玻璃体腔注射4 μL AAV2-ND4,注射后灌胃予以口服药物28 d,A组不予以免疫抑制治疗,B组口服环孢霉素A[起始剂量10 mg/(kg·d),14 d后减半],C组口服强的松[起始剂量5 mg/(kg·d),14 d后减半],D组玻璃体腔同时注射曲安奈德,并口服强的松(剂量同C组),对照组(E组)单次玻璃体腔注射4 μL磷酸缓冲盐溶液.分别于注射AAV2-ND4后3、7、28、56、84 d后检测血清中AAV2和ND4的抗体含量,同时于第84 d观察鼠视网膜上ND4的表达.结果 A~D各组抗ND4基因抗体浓度在第56天时均明显增加,以A、C组为显著;第84天时,除D组外各组抗体浓度均出现不同程度下降.A~D各组抗AAV2抗体浓度在第28天时明显增加,以A、C组为显著;第56天时除B组外各组抗体浓度均出现下降.实验各组的视网膜神经节细胞层在注射第84天仍有明显ND4表达.结论 免疫反应主要集中在玻璃体腔注射AAV2-ND4后56 d内;各个方案的免疫抑制效果均不理想;不同免疫抑制治疗方案对ND4的表达效率无明显影响.
关键词： Leber遗传性视神经病变 ND4基因 基因转染 免疫抑制 -
四川黑熊NADH脱氢酶亚基4基因的序列分析
目的 探讨黑熊线粒体ND4基因的序列特点.方法 根据已报道的若干物种的NADH脱氢酶亚基4基因(ND4)设计引物.运用PCR技术从四川黑熊毛囊组织的总DNA中扩增出ND4基因.并对ND4基因进行分析.结果 PCR扩增所得DNA序列长度为1 402 bp,该序列包含了ND4基因,其ORF为1 377 bp,编码459个氨基酸,编码蛋白的分子量为51.5×103,pI为9.37.四川黑熊的ND4基因序列及其所编码的氨基酸序列与美洲黑熊、马来熊、棕熊、北极熊、人、大鼠、小鼠和狗等其他哺乳动物的ND4基因序列和对应的氨基酸序列具有较高的相似性,分别为68%～91%和71%～95%.拓扑结构预测显示四川黑熊ND4基因的蛋白质上分别存在N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-酰基化位点、亮氨酸拉链以及富含亮氨酸的区域.结论 哺乳类动物的ND4基因具较高的保守性,而其所编码的蛋白在功能上具有高度的一致性.
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家族性糖尿病人群中线粒体ND4基因12026 A→G突变的分析研究
目的 了解线粒体 ND4基因mt12026 A→G变异在中国人家族性糖尿病人群中的发生率及其临床特点.方法 应用PCR-限制性片段长度多态性技术结合直接测序方法对随机抽取的无亲缘关系的770个糖尿病家系的先证者及309名非糖尿病对照者进行线粒体基因mt12026 A→G变异的筛查.结果 在糖尿病先证者组中发现28例(3.63%)mt12026 A→G变异,而在正常对照组中发现9例(2.91%),两组间变异的发生率差异无统计学意义.伴mt12026 A→G的糖尿病组与无该变异的糖尿病组之间的临床特点(年龄、体重指数、胰岛素抵抗指数)比较差异无统计学意义.结论 线粒体 ND4基因mt12026 A→G变异可能不是中国人线粒体糖尿病发病的致病原因,而是中国人线粒体的一种基因多态.
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线粒体DNA ND4基因12026(A→G)点突变与2型糖尿病相关性研究
目的 研究中国云南2型糖尿病人群线粒体ND4基因ntl2026A→G点突变的发生频率及其与2型糖尿病的相关性.寻求准确、快速、简易的临床糖尿病基因诊断方法.方法 随机选取350例中国云南2型糖尿病患者和225例无糖尿病家族史的健康对照者作为研究对象.通过聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测线粒体12026A→G点突变.结果 经DNA直接测序确证.结果 350例2型糖尿病患者中12026A→G点突变者11例(3.14%),225例对照者中携带该突变者6例(2.67%),突变发生率在两组间差异尤统计学意义(x2=0.0059,P=0.8064).结论 线粒体ND4基因12026A→G突变可能仪为人群中线粒体基因组的正常多态,不是中国(特别是云南)人群中2型糖尿病的常见致病因.
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线粒体16srRNA和ND4基因在种属鉴定中的应用研究
目的 构建一种用于种属鉴定的线粒体DNA(mtDNA)16srRNA和ND4基因荧光标记复合扩增检测体系.方法 利用引物设计软件(Primer 5)对两个mtDNA序列ND4基因和16srRNA基因设计两对引物,每对引物中的一条在5'端标记荧光素(6-FAM).按传统复合扩增技术建立复合扩增体系,用ABI PRISM 310基因分析仪对产物进行分析.结果 人类DNA扩增产物出现两个峰,片段大小分别为110bp的人类特异片段和149bp的人与动物共有片段,而动物DNA扩增产物出现一个峰,片段大小为149bp.对30个实验室存放5～15年的陈旧人血痕也能明确判断其种属来源.结论 该体系可以明确区分人源性生物检材与其它常见动物样本,对实验室长期存放的陈旧检材也具有较好的检测能力.
