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肺炎克雷伯菌CRP调控子对细菌毒力影响与机制研究
目的:了解肺炎克雷伯菌调控因子CRP对细菌毒力的影响及其对毒力相关因子磷酸转移酶系统的作用及其机制.方法:构建肺炎克雷伯菌CRP调控因子的基因缺失突变株与回补株,小鼠毒力试验检测CRP对细菌LD50的影响及小鼠生存率的影响,qRT-PCR与lacZ报告基因检测CRP对果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因的影响并通过凝胶阻滞试验(EMSA试验)检测CRP调控frwC基因的机制.结果:CRP基因敲除菌株的小鼠毒力明显下降,野生株、CRP基因缺失株及回补株的LD50分别为＜100,3.2× 105和4.5×104 CFUs.qRT-PCR与lacZ报告基因发现CRP基因敲除后,果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因表达量明显下降,EMSA试验发现CRP蛋白能够结合在frwC启动子区.结论:肺炎克雷伯菌CRP调控子与细菌毒力密切相关,并且能够直接正调控frwC基因的表达.除影响细菌荚膜、菌毛、生物膜的形成而影响细菌毒力外,CRP调控子可能通过影响磷酸转移酶系统而影响细菌毒力.
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变异链球菌磷酸转移酶系统ptxA、ptxB基因对细菌生长能力的影响
目的：研究变异链球菌（S. mutans）磷酸转移酶系统（PTS）中抗坏血酸家族ptxA、ptxB基因对细菌生长能力的影响。方法构建ptxA、ptxB和ptxAB双重基因缺陷菌株以及ptxAB功能补偿菌株。在仅以抗坏血酸作为唯一碳源时，使用实时荧光定量聚合酶链反应检测野生株中ptxA、ptxB基因的表达情况。连续监测野生株、缺陷株和补偿株的菌液OD600值，比较其生长能力。结果经过聚合酶链反应和测序鉴定，结果证明缺陷株和补偿株构建成功。在以抗坏血酸作为唯一碳源的培养基中，野生株ptxA、ptxB基因的表达量均明显增高（P<0.01）。缺陷株的生长能力较野生株有所下降，但是在补偿株中可以得到补偿。结论ptxA、ptxB基因与S. mutans对抗坏血酸的吸收利用密切相关，缺陷株和补偿株的构建为进一步研究目的基因在S. mutans抗坏血酸代谢中的作用机制提供了理论基础。
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肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统EⅡC编码基因frwC缺失株的构建及表型分析
目的 利用同源重组技术构建肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统(PTS系统)EⅡC编码基因frwC无痕缺失株,并构建回补株,探讨frwC基因对肺炎克雷伯菌生长、超黏表型及毒力的影响.方法 利用自杀载体pKO3-Km质粒构建frwC基因缺失株,同时扩增包含frwC基因编码区、启动区及转录终止区的基因片段,克隆至pGEM-T-easy质粒电转至缺失株构建frwC基因回补株.通过生长曲线测定、高速离心实验、小鼠毒力实验分析frwC基因对肺炎克雷伯菌生长、超黏表型及毒力的影响.结果成功构建了肺炎克雷伯菌frwC基因缺失株与回补株,发现frwC基因敲除后细菌生长速度下降、黏性增加、细菌毒力减弱.结论 肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统 frwC 基因编码蛋白 EⅡC 影响细菌的生成、超黏表型及毒力.
