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自身激活作用文献资料
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小鼠Dnd1酵母双杂交系统诱饵载体的构建及自身激活检测
目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并检测其是否有自身激活作用.方法:设计引物引入Sal Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点,使用PCR方法从质粒peDNA3.1-Dnd1中扩增小鼠Dnd1基因的编码区序列,连至pMD18-T载体.酶切验证及测序正确后,用Sal Ⅰ,Not Ⅰ内切酶分别消化pMD-T-Dnd1及pDBLeu载体而后构建诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并检测其在GIBCO/BRL公司的酵母双杂交系统中的自身激活作用.结果:成功构建诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并证明其在该系统中无自身激活作用.结论:pDBLeu-Dnd1可应用该酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白.
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p65 DNA结合域的克隆、表达及其酵母双杂交自身激活作用检测
目的获得NF-κB p65亚基DNA结合域cDNA及构建酵母双杂交系统中的靶基因,并检测靶基因的表达和自身激活活性.方法利用引物二聚体搭桥技术,扩增p65亚基DNA结合域基因片段,并将其克隆入酵母双杂交载体pGBKT7 DNA-BD.应用醋酸锂法转化酵母细胞AH109,在SD/-Trp选择培养基上培养,观察转化株的生长情况.按尿素/SDS法抽提酵母蛋白,用SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定靶蛋白在酵母细胞中的表达.利用液相法和平板法检测阳性转化株β-半乳糖苷酶的活性.结果获得p65 DNA结合域基因片段,并成功构建酵母双杂交系统中的靶基因.靶基因能在酵母细胞中表达,对酵母细胞无毒性作用,无自身激活活性.结论 NF-κB p65亚基DNA结合域可作为酵母双杂合系统中的靶基因,用于肽库筛选,捕捉与之相互作用的多肽.
