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基于同源重组和反向PCR扩增技术构建BRD7溴区结构域缺失突变体
目的:利用同源重组和反向PCR扩增技术构建溴区包含蛋白7(bromodomain-containing protein 7,BRD7)的溴区结构域(bromodomain)缺失的真核表达载体.方法:设计一对反向PCR引物,以预先构建好的pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7质粒为模板,利用高保真酶的高保真性和较长的延伸能力,反向扩增出BRD7溴区结构域缺失突变体(pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd)的线性DNA片段,然后转化大肠杆菌,利用大肠杆菌同源重组修复能力即可自身环化,而不需要经连接酶连接或其他处理即可得到pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd重组表达质粒,通过测序和Western印迹进一步对该缺失突变体的序列和蛋白质表达性能进行验证.结果:通过酶切鉴定、测序和Western印迹证实pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd构建成功.结论:利用PCR反向扩增和同源重组技术,可以简便快速地构建pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd突变体,实验成本较低,并且发现质粒模板浓度会影响载体的同源重组效率,这种改进的技术可广泛应用到基因突变体的构建.
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BRD-7基因溴区结构域的真核表达及其特征研究
背景与目的:BRD-7基因是我室自己克隆的一个新基因,它包含一个溴区结构域.研究表明BRD-7基因能明显抑制鼻咽癌细胞的生长,是一个良好的鼻咽癌候选抑瘤基因.为了阐明BRD-7基因的作用机制,我们首先对其溴区结构域进行了初步的研究.方法:通过定向克隆,我们构建了BRD-7基因溴区结构域的真核表达载体,并进行了诱导表达,Western-EP迹检验结果的真实性.另外,我们运用生物信息学对BRD-7溴区结构域进行了分析.结果:我们构建重组表达质粒PGEX-4T-2/bromodomain,经酶切鉴定和测序验证表达载体构建正确.经IPTG诱导,SDS-PAGE分析在大肠杆菌中成功诱导表达了分子量为38.8KD的融合蛋白,用Western-EP迹证实了融合蛋白的表达.通过氨基酸序列的一级结构,二级结构的分析及其同源匹配,我们发现BRD-7溴区蛋白与三个结构已知的溴区蛋白具有高度相似性:可能含有四个α螺旋(Z,A,B,C),螺旋与螺旋之间通过环伴连接(ZAloop,BCloop),并且含有一个由疏水氨基酸形成的"口袋",通过这个结构,能特异性识别乙酰化的组蛋白.结论:通过同源比较,BRD-7溴区蛋白应属与溴区蛋白家族联合作用因子亚群,并且可能具有特异性识别乙酰化组蛋白的功能.
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hSmarca2-b转录变体编码的hBRM-b异构体促进Hep-3B细胞凋亡
目的 考察hSmarca2-b转录变体编码的hBRM-b异构体蛋白是否具有促进Hep-3B肿瘤细胞凋亡的作用.方法 利用pEGFP-N1质粒构建5种包含hSmarca2-b转录变体的5′调控序列、全长开放阅读框的部分cDNA序列以及能进一步编码产生hBRM-b-EGFP融合蛋白的过表达载体;脂质体转染过表达载体分别进入hSmarca2-b表达缺失的Hep-3B肝癌细胞,通过RT-PCR 和 Western Blot分别验证其mRNA的转录及hBRM-b-EGFP融合蛋白的表达,并通过荧光成像进一步验证融合蛋白的产生;流式检测转染hBRM-b-EGFP过表达载体后的Hep-3B细胞,考察相对于空载体组凋亡情况的改变.结果 RT-PCR显示,Hep-3B细胞转染后hSmarca2-b变体表达水平从无到较高,Western Blot检测到符合理论大小的融合蛋白,荧光成像时可见转染细胞发出的绿色荧光,证明过表达载体构建成功;相对于空载体组,其中4种变体的过表达均使凋亡细胞比例增加近100%,单侧t检验显示差异有统计学意义(P<0.05).结论 hSmarca2-b转录变体编码的hBRM-b异构体蛋白具有促进Hep-3B肝癌细胞凋亡的作用.
