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双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立
目的 建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法.方法 根据GenBank公布的EHEC stx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记.建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析.结果 建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法.菌液浓度为102～108 cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100％;3次重复测定108、105、102 cfu/ml 3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5％,在误差允许范围内.结论 建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC.
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肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化
目的 制备肠出血型大肠埃希菌(EHEC) O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化.方法 生物信息学方法分析EHEC O157:H7 EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白(KLH),免疫新西兰大白兔制备抗血清.ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度.结果 选择EspF蛋白抗原指数高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA- 86 (0.506)为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78％,经质谱分析其分子量为1 563.76 Mr,与目的多肽分子量一致；加强免疫3次后,EHEC O157:H7 EspF蛋白的抗血清效价达1∶2048 000;该血清对EHEC O157:H7野生株和espF突变株(△espF)的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体.结论 成功地制备了效价高、特异性强的EHEC O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体.
