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肾上腺髓质素通过调控Rho GTPases促进足细胞细胞间接触的形成
目的 通过观察肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)对足细胞细胞黏附分子和肌动蛋白相关蛋白的调控作用及相关机制,探讨AM对足细胞细胞间接触形成的影响.方法 将温度敏感型小鼠足细胞株分为对照组、AM处理组(10-7 mol/L)及AM联合蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89(10-6mol/L)处理组,并以腺苷酸环化酶激活剂福司柯林(forskolin)处理组(10-5 mol/L)作为阳性对照组.作用12h后,经免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜,观察细胞黏附分子和肌动蛋白相关蛋白的表达改变,并经Western印迹法检测其蛋白表达水平;采用谷胱甘肽巯基转移酶-拉下实验(GST-pull down assay)法检测Rho GTPases酶活性变化,Western印迹法检测其蛋白表达水平.结果 经AM作用12 h后,细胞黏附分子、肌动蛋白相关蛋白以及肌动蛋白F-actin均向细胞间接触集聚表达,该效应与forskolin作用一致,且可被H89阻断,但其蛋白水平均未见明显改变(P＞0.05).AM可分别上调RhoA、Rac1及Cdc 42的酶活性水平(P＜0.05),该作用被H89部分阻断,其总蛋白水平未见明显变化(P＞0.05).结论 AM可促进足细胞细胞间接触的形成,其作用机制可能与AM上调RhoA、Rac1和Cdc42酶活性,从而促进细胞黏附分子、肌动蛋白相关蛋白及肌动蛋白的重排密切相关,该效应部分由cAMP-PKA信号通路介导.
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细胞间接触诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究
目的 通过两种细胞的共培养探讨细胞间接触对间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化的影响.方法 分别采用密度梯度离心法和胶原酶消化法分离培养了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)和膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells, BSMCs).并对其进行了鉴定.在此基础上以单独培养的BMSCs和BSMCs分别作为阴性和阳性对照组,将获得的BMSCs和BSMCs在体外通过接触与非接触共培养作为实验组,对诱导后的BMSCs是否向平滑肌(smooth muscle cells, SMCs)分化通过免疫荧光和Western blot进行鉴定.结果 对BMSCs进行流式细胞术检测结果显示CD90、 CD44表达阳性率分别为99.78%,60.27%,CD45表达阴性,阳性率为0.21%.在BMSCs 与BMSCs共同培养的实验中,Western blot结果显示:BMSCs本身表达少量calponin蛋白,接触组calponin的表达随培养时间的延长逐渐增多,非接触组无明显变化;免疫荧光显示:接触组在共培养第8天部分细胞抗calponin阳性,非接触组与诱导前无明显变化. 结论初步认为BMSCs与BMSCs接触共同培养能诱导BMSCs向平滑肌分化.
