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葎草花粉变应原核酸疫苗通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用
目的：构建葎草花粉变应原核酸疫苗pcDNA3.1-Hum，并探讨其是否通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用。方法双酶切pTripIEx2-Hum质粒以获取目的基因，定向插入pcDNA3.1(-)载体以构建pcDNA3.1-Hum核酸疫苗并测序鉴定，转染至COS-7细胞以证实其表达。采用表达的目的蛋白刺激CD4+CD25-T细胞，验证其能否诱导Foxp3+Treg细胞分化。使用pcDNA3.1-Hum免疫正常小鼠，检测特异性IgE、IgG2a水平以探讨其免疫原性、变应原性；免疫哮喘模型小鼠以验证其免疫保护作用。结果测序证实该构建成功并可在真核细胞内表达；证实表达的目的蛋白可诱导CD4+CD25-T细胞向Foxp3+Treg细胞分化。动物实验提示pcDNA3.1-Hum可诱导特异性IgG2a，不能诱导特异性IgE；可明显降低哮喘模型小鼠气道炎症反应、气道高反应性；升高脾脏Foxp3+Treg细胞百分比；降低IL-4、升高IFN-γ水平。结论成功构建了pcDNA3.1-Hum核酸疫苗，表达的目的蛋白可介导Foxp3+Treg细胞分化。动物实验证实该疫苗具有免疫原性及免疫保护作用，并提示其通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导Th1倾向的免疫保护作用。
关键词： 变应性哮喘 葎草花粉变应原 核酸疫苗 免疫原性 Foxp3+Treg细胞 -
重组葎草花粉主要变应原免疫特性研究
目的 鉴定重组葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫特性,并初步评价其安全性.方法 应用Western blotting鉴定pTSX2的免疫特性；ELISA法检测经pTSX2免疫的小鼠血清sIgE、sIgG水平；pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后:ELISA法测定小鼠血清sIgE、sIgG水平；计数小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞(Eos)比值；ELISA法检测小鼠BALF中及脾组织匀浆中细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平；评价小鼠肺组织炎症程度.结果 Western blotting结果显示重组表达的pTSX2可与70％的葎草花粉特异性过敏的变应性哮喘患者血清发生抗原抗体反应；pTSX2免疫正常小鼠后主要诱导产生血清sIgG;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后:血清中sIgE、sIgG的抗体水平分别为(146.74±28.57)和(548.76±11.98)μg/ml,与哮喘模型组的(603.06±10.00)和(260.32±6.40)μg/ml相比差异有统计学意义(P＜0.05);BALF中细胞总数及Eos百分比与哮喘模型组相比明显下降(P＜0.05)；BALF中IL-4、IFN-γ水平分别为(56.74±28.57)和(49.7±11.98)pg/ml,与哮喘模型组的(89.03± 10.00)和(23.10±6.40)pg/ml相比差异有统计学意义(P＜0.05)；脾组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平分别为(126.24±37.00)和(1547.72±490.43)pg/ml,与哮喘模型组的(457.95±70.06)和(720.34±93.96)pg/ml相比差异有统计学意义(P＜0.05)；肺组织炎症程度减轻.结论 重组葎草花粉主要变应原pTSX2具有较好的免疫治疗作用,且安全性较高,其机制可能是抑制变应原sIgE抗体、诱导变应原sIgG抗体产生,降低气道炎症细胞浸润,调节Th1/Ih2平衡.
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葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的构建及其免疫原性鉴定
目的 构建葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA-LC2并鉴定其免疫原性.方法 将pTripIEx2-LC2质粒用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切得到LC2葎草花粉变应原基因片段,将其插入pcDNA3.1(-)真核表达载体,在鉴定重组质粒构建成功后,大量制备去内毒素核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,应用pcDNA3.1-LC2核酸疫苗免疫小鼠,取免疫血清行双向免疫扩散实验,分析其免疫原性.结果 通过测序确认构建pcDNA3.1-LC2中的672bp的编码框碱基与原序列一致,没有突变及缺失.应用pcDNA3.1-LC2免疫BALB/c小鼠,经双向免疫扩散试验验证pcDNA3.1-LC2在小鼠体内可以表达并产生特异性抗体.结论 成功的构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,pcDNA3.1- LC2可在小鼠体内表达,并能产生葎草花粉变应原特异性抗体,具有良好的免疫原性.
