首页 > 文献资料
-
AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用
目的：构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体，并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE)，将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10，通过Real-time PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达，EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞，荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞，荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体，Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体， EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力，而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性，而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高，其中BMP9为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性，并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。
-
AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨
目的:研究转录蛋白2(activator protein 2,AP2)α在骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制.方法:重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△bHLH和AP2α-△TAD抑制AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化.结果:BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、OPN及骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的增高(OC:F=56.929,P=0.000;OPN:F=54.789,P=0.000; OPG:F=159.451,P=0.000),ALP活性(F=69.776,P=0.000)及红色钙盐沉积减少.结论:BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程.
