首页 > 文献资料
-
人表皮生长因子受体显性负性突变体对胃癌细胞体外生长能力的影响
目的 探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR)对人胃癌细胞体外生长能力的影响及其分子机制.方法 用质粒pEGFPN1-DNEGFR转染人胃癌NCI-N87和SGC-7901细胞,并筛选稳定转染细胞株;采用MTT法检测人胃癌细胞体外生长能力,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP) nick-end labeling,TUNEL]法检测细胞凋亡情况,ELISA法检测胞浆中活性caspase-3蛋白水平,Western blot法检测ser 9位点磷酸化糖原合成激酶-3β[phosphorylated glycogen synthase kinase-3 beta,pGSK-3β(ser 9)]蛋白表达水平.结果 成功筛选出4株稳定转染细胞株;质粒pEGFPN1-DNEGFR分别转染的NCI-N87和SGC-790细胞体外生长能力均降低,凋亡指数(apoptotic index,AI)均升高,胞浆中活性caspase-3蛋白水平均升高,pGSK-3β(ser 9)蛋白水平均降低,与对应的空质粒转染组及未转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 DNEGFR通过caspase相关的凋亡信号转导通路及糖原合成激酶-3β(GSK-3β)促凋亡作用诱导胃癌细胞凋亡,使其体外生长能力明显降低,为DNEGFR在胃癌生物治疗中的深入研究提供了部分理论依据,为胃癌的生物治疗提供了新思路.
-
靶向表皮生长因子受体的肿瘤生物治疗方法研究进展
肿瘤生物治疗(cancer biotherapy)已经成为继手术、放疗和化疗三大经典肿瘤治疗模式后的第四模式.在肿瘤生物治疗中,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶点扮演着重要角色.EGFR为一种相对分子质量为170 000的酪氨酸蛋白激酶型受体,在多种恶性肿瘤存在过表达,在肿瘤发生、发展中起着重要作用.靶向EGFR的肿瘤生物治疗方法主要包括:基因沉默治疗、显性负性治疗、单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)治疗、生物"导弹"治疗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR TKI)治疗、双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)治疗方法等.目前靶向EGFR的肿瘤生物治疗研究已经取得较大进展,随着研究的进一步深入,肿瘤的治疗必将跨入一个全新的时代.
-
VPS4B显性负性突变体抑制乙型肝炎病毒复制
目的 观察细胞液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)显性负性突变体VPS4B-K180Q在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的效应.方法 用不同剂量野生型VPS4B真核表达质粒pXF3H-VPS4B和K180Q突变型真核表达质粒pXF3H-K180Q与pHBVl.3共转染Huh7细胞,时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)定量检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg含量,Southernblot分析细胞内HBV核衣壳相关DNA水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化.结果 野生型VPS4B可抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较弱;低剂量突变型VPS4可显著抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较强,且均呈剂量依赖的抑制效应.结果 计 VPS4B及其显性负性突变体可在体外表现出抗HBV的作用,突变型VPS4B抑制HBV能力高于野生型VPS4B.
关键词： 乙型肝炎病毒 细胞液泡蛋白质分选因子 显性负性突变体 -
热休克转录因子1及其突变体的研究进展
热休克因子1(HSF1)是一种转录因子,在正常时不活化,应激时活化而具有反式激活能力.在其蛋白质结构中含有DNA结合域、三聚结构域、调节结构域、转录活化结构域等,它们在HSF1活化过程中各自发挥重要作用.通过改变HSF1的结构构建其突变体,能特异地引起或阻碍HSF1的活化.这些突变体已应用于心血管疾病、肿瘤、神经系统疾病的研究.
-
AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用
目的：构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体，并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE)，将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10，通过Real-time PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达，EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞，荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞，荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体，Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体， EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力，而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性，而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高，其中BMP9为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性，并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。
-
人表皮生长因子受体显性负性突变体对胃癌细胞体外侵袭转移能力的抑制作用
目的:探讨人表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)显性负性突变体(Dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR)对胃癌细胞体外侵袭转移能力的影响及其分子机制.方法:构建pEGFPN1-DN EGFR,转染人胃癌细胞并筛选稳定转染株,采用Transwell侵袭小室模型检测人胃癌细胞体外侵袭转移能力,RT-PCR检测细胞基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)mRNA水平,酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养液MMP-2和MMP-9蛋白水平.结果:成功构建pEGFPN1-DNEGFR,转染并筛选出稳定转染株,检测到人胃癌细胞体外侵袭转移能力降低,细胞MMP-2和MMP-9 mRNA水平降低,培养液MMP-2和MMP-9蛋白水平降低.结论:DNEGFR通过抑制人胃癌细胞分泌MMP-2和MMP-9,使其体外侵袭转移能力显著降低,将为DNEGFR在胃癌生物治疗中的深入研究打下基础.
-
AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨
目的:研究转录蛋白2(activator protein 2,AP2)α在骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制.方法:重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△bHLH和AP2α-△TAD抑制AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化.结果:BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、OPN及骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的增高(OC:F=56.929,P=0.000;OPN:F=54.789,P=0.000; OPG:F=159.451,P=0.000),ALP活性(F=69.776,P=0.000)及红色钙盐沉积减少.结论:BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程.
-
人EGFR显性负性突变体真核表达载体的构建、蛋白表达及亚细胞结构定位
目的:构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,转染COS-7细胞,检测DNEGFR-EGFP的表达并进行亚细胞结构定位.方法:将RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法扩增得到编码EGFR信号肽段、胞外区和跨膜区的cDNA,定向克隆至空载体pEGFP-N1中,构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR.经PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证明pEGFPN1-DNEGFR构建成功后,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,应用光谱激光扫描共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测.结果:PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证实pEGFPN1-DNEGFR构建成功,并且Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,光谱激光扫描共聚焦显微镜观察显示DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜.结论:成功构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体,并在COS-7细胞胞膜上表达,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤基因治疗中的进一步研究打下基础.
-
VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制
目的: 了解VP22融合型显性负性(DN)突变体对抑制乙肝病毒(HBV)复制的作用. 方法: 将VP22全长及其不同区段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端,克隆入pcDNA3.1(-)构成DN突变体真核表达质粒. 转染HepG2.2.15细胞后,免疫荧光鉴定DN突变体在细胞内的表达,并以培养上清HBV表面抗原(HBsAg)的浓度为指标,观察DN突变体对HBV病毒复制的抑制效应. 同时以MTT比色法观察转基因的表达对宿主细胞生长状态的影响. 结果: VP22及其不同区段构建的DN突变体可在HepG2.2.15细胞中进行表达,且对宿主细胞无毒性. VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV的复制,具有蛋白转导特性的DN突变体比无转导特性的DN突变体具有更强的抗病毒能力. 其中VP22全长构成的DN突变体具有强的抑制效应,可使上清HBsAg浓度下降81.94%. 结论: VP22融合型DN突变体可以增强DN突变体对HBV复制的抑制.
