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α-toxin调控miR-142表达抑制巨噬细胞吞噬功能的机制研究
目的 探讨金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)分泌的α-外毒素(Hla)调控miR-142表达并抑制巨噬细胞吞噬功能的分子机制.方法 采用野生型金葡菌菌株(WT S.aureus)、Hla缺失金葡菌菌株(△HlaS.aureus)及磷酸盐缓冲液(PBS)感染BALB/C小鼠背部皮肤、RAW264.7鼠源巨噬细胞,检测感染后皮肤组织和巨噬细胞miR-142表达水平.构建荧光素酶报告基因载体,采用荧光素酶活性实验分析miR-142对蛋白激酶Cα(PKCα)表达水平的调控作用.在RAW264.7细胞中过表达miR-142模拟物,分析细胞吞噬能力.结果 与PBS处理组相比,△HlaS.aureus与WT S.aureus处理组皮肤组织和巨噬细胞miR-142表达水平下降(P<0.05).MiR-142模拟物可抑制荧光素酶活性,抑制巨噬细胞RAW264.7细胞的吞噬能力(P<0.05).结论 金葡菌分泌的H1a促进巨噬细胞表达miR-142,进而通过下调PKCα表达水平抑制巨噬细胞的吞噬功能.
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miR-142通过上调AKT2的表达促进角膜新生血管形成
目的:研究microRNA 142(miR-142)对角膜新生血管形成的影响及其相关机制.方法:实验设置空白对照组、阴性对照组、过表达miR-142组以及干扰miR-142组,分别利用miR-142模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)过表达和干扰miR-142;CCK-8增殖实验检测miR-142对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖能力的影响;双荧光素酶报告基因验证AKT2是否为miR-142的直接靶基因;RT-PCR和Western blot实验检测miR-142对AKT2表达水平的影响.结果:CCK-8增殖实验结果显示空白对照组、阴性对照组和过表达miR-142组96 h的吸光度(absorbance,A)均值分别为872.21±44.20、842.16±49.54和1 407.91±16.58,差异具有统计学意义(F=102.8,P=0.000).干扰miR-142后HUVECs增殖能力明显减弱(空白对照组=919.69±25.46,阴性对照组=856.76±36.22,干扰miR-142组=602.77±25.62;F=72.8,P=-0.000).双荧光素酶报告基因结果发现过表达miR-142后AKT2表达水平没有明显变化(对照组=0.36,过表达miR-142组=0.46,P=0.147).RT-PCR结果显示过表达miR-142(0.408±0.046)后AKT2表达水平较阴性对照组(0.173±0.022)升高(P=0.018),干扰miR-142组(0.16±0.02)较阴性对照组(0.362±0.068)明显降低(P=0.037),差异均具有统计学意义.Western blot实验进一步验证了miR-142对AKT2基因的调控作用.进一步研究发现,shRNA干扰AKT2后miR-142促进HUVECs增殖的作用消失,对照组、过表达miR-142组、过表达miR-142+shRNA-AKT2组和shRNA-AKT2组的96 h吸光度值分别为981.80±75.40、1 357.81±47.56、806.39±49.70和921.59±40.38,差异具有统计学意义(F=40.97,P=0.000).结论:miR-142通过上调AKT2的表达促进HUVECs增殖,从而促进角膜新生血管形成.
