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葡萄糖调节蛋白GRP78与HBV的PreS1相互作用位点的初步研究
目的:初步研究78 kD的葡萄糖调节蛋白(the 78 kD glucose-regulated protein,GRP78)与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的前S1蛋白(PreS1)的相互作用位点.方法:利用PCR技术扩增GRP78的基因,将扩增的目的基因克隆至pW28载体质粒,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)B834中表达,经过镍离子亲和层析柱纯化GRP78蛋白;将PreS1 3个截短片段的重组质粒(pGST-PreS1-X1/X2/X3)在B834中表达后,经过GST亲和层析柱纯化相应蛋白;利用蛋白质体外结合实验(pull down)、微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)检测GRP78与PreS1 3个截短片段的相互作用.结果:成功构建重组质粒pW28-GRP78;获得GRP78蛋白及PreS1 3个截短片段的融合蛋白;pull down及MST实验验证了GRP78可以与PreS1的3个片段结合,且GRP78与GST-PreS1-X1结合效果好.结论:利用分子克隆技术及蛋白质表达纯化技术,获得GRP78蛋白及PreS1截短片段的融合蛋白,并初步筛选了PreS1与GRP78的相互作用位点,为后续研究打基础.
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人红细胞内血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶2的相互作用
目的 研究人红细胞内硫氧还蛋白过氧化物酶2(Prx2)与血红蛋白(Hb)的相互作用.方法 首先利用红细胞Hb再释放试验分离红细胞和溶血液电泳释放的4个区带,即HbA、HbA2、HbA与HbA2之间(HbA-A2)及再释放Hb,将这些区带分别切下,通过反复冻融获得各区带所合蛋白;用葡聚糖G-25浓缩后再利用SDS-PAGE分离各区带所含蛋白组分,并用抗-Prx2做免疫印迹分析;后用微量热泳动试验(MST)分别检测Prx2蛋白与HbA和HbA2之间的结合常数.结果 红细胞电泳释放的区带HbA、HbA2、HbA-A2及再释放Hb中均有Prx2;而溶血液电泳释放的Hb区带中,除HbA2外其余各Hb区带中均有Prx2.MST检测显示,Prx2蛋白与HbA的结合常数(Kd值)为(14±1.08) μmol/L,而与HbA2之间的Kd值未被检测到.结论 Prx2与HbA之间存在相互作用,但与HbA2之间可能没有相互作用.
