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三基序蛋白25过表达对肺癌细胞H1299顺铂敏感性的影响
目的:初步探讨三基序蛋白25 (tripartite motif containing 25,TRIM25)过表达对人肺癌细胞株H1299顺铂敏感性的影响及其分子作用机制.方法:应用基因克隆技术构建TRIM25高表达质粒载体,瞬时转染人肺癌细胞株H1299,荧光显微镜下观察转染效率,Western blot法检测TRIM25蛋白表达水平及其过表达时丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2)蛋白水平的变化.用顺铂分别处理转染前后的H1299细胞24h,MTT法检测细胞耐药性,Annexin V/PI双染法流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡.结果:同H1299空白组和转染pGCMV/neo空载体组比较,pGCMV-trim25转染组细胞中TRIM25蛋白的表达水平明显增加(P=0.003,P=0.005);且TRIM25过表达时,细胞中PKM2蛋白的表达水平降低(P=0.001,P=0.003).用顺铂处理后,pGCMV-trim25转染组细胞的药物敏感性显著下降(P＜0.001),转染组细胞凋亡率亦明显降低(P＜0.001).结论:TRIM25在肺癌细胞H1299中高表达时,可能通过下调PKM2而降低对顺铂的敏感性.
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转录因子Smad2高表达载体的构建和鉴定
目的 构建并鉴定大鼠转录因子Smad2的高表达载体(简称pLJM1-Smad2).方法 首先以E3大鼠肝脏cD-NA为模板、PCR法获取转录因子Smad2 mRNA CDS区(即目的基因片段);然后用AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切pLJM1-MGFP载体和目的基因片段,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;之后再将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,扩大培养并提取重组质粒;后用PCR、AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切以及DNA测序鉴定重组质粒.结果 PCR、AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切结果均提示pLJM1-Smad2重组载体中插入了目的片段Smad2;将含有目的片段的阳性重组体克隆送上海生工进行DNA测序,并将测序结果与NCBI数据库的进行比对,确定插入片段无突变、序列完全正确,证实pLJM1-Smad2重组载体中成功插入了目的基因片段Smad2.结论 成功构建了转录因子Smad2的高表达载体pLJM1-Smad2.
