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钙离子释放激活通道文献资料
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SELEX技术筛选钙通道特异性核酸适配体及其抗肥大细胞活化的作用
目的 筛选针对Orai1分子第1膜外区蛋白的核酸适配体,探讨适配体通过拮抗钙离子释放激活通道(Ca2+ release activation channel,CRAC)抑制肥大细胞活化的效应.方法 构建随机单链DNA文库,利用不对称PCR对单链DNA文库进行扩增.采用聚苯乙烯酶联板为介质的指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术筛选核酸适配体.利用酶联免疫吸附实验检测各轮筛选序列与靶蛋白的亲和力,验证适配体与靶蛋白的特异性结合；激光共聚焦显微镜观察适配体对细胞内钙离子浓度变化的影响；利用IgE介导的肥大细胞脱颗粒模型,观察适配体对β-氨基己糖苷酶释放的抑制效应.结果 经过12轮SELEX筛选,获得了7条核酸适配体,其中AptamerY1解离常数(Kd值)为1.72×10-8 mol/L.以终浓度2μg/mL的AptamerY1可抑制由IgE介导的人肥大细胞系LAD2钙离子内流,并对LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放抑制率达95％.结论 通过SELEX筛选,获得了7条针对Orai1分子第1膜外区的核酸适配体,所获得适配体可对肥大细胞LAD2钙内流有效抑制,进而抑制肥大细胞活化和β-氨基己糖苷酶的释放.
