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常用注射用辅料刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的作用
目的 研究多种注射用辅料刺激肥大细胞RBL-2H3脱颗粒的作用,建立和完善注射用辅科引发类过敏反应的筛选评价体系.方法 以不同浓度的注射用辅料羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物40/60( mPEG-PDLLA40/60)、聚乙二醇400(PEG400)、聚乙二醇600 (PEG600)、聚氧乙烯蓖麻油(CrEL)和吐温80处理RBL-2H3细胞,测定β-氨基己糖苷酶释放率,并通过MTT法进一步研究有脱颗粒作用的受试物对RBL-2H3细胞的毒性作用.结果 HP-β-CD、高浓度的mPEG-PDLLA40/60( 40 mg/ml)和吐温80(3.0 mg/ml)均能直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒,呈浓度依赖性；PEG400、PEG600和CrEL在本研究的浓度范围内均不能直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒.HP-β-CD有明显的细胞毒性,但不呈浓度依赖性；mPEG-PDLLA40/60无细胞毒性；吐温80没有明显的细胞毒性,但呈浓度依赖性.结论 RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶释放试验方法灵敏、重复性好,其结果与临床报道有一定的相关性,提示其有评价注射用辅科类过敏反应的潜在应用价值.高浓度的吐温80直接刺激肥大细胞脱颗粒的作用可能是由其细胞毒性引起的.
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抗炎一号对活化嗜碱性白血病细胞脱颗粒的影响
目的 探讨抗炎一号对抗二硝基苯基化免疫球蛋白IgE(anti-dinitrophenol specific immunoglubinE,抗-DNP IgE)与二硝基苯基化牛白蛋白(dinitrophenol-bovine serum albumin,DNP-BSA)复合物刺激大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)脱颗粒与白细胞介素4(IL-4)释放的抑制作用,从而阐明其抗过敏机理.方法 用RBL-2H3细胞脱颗粒抑制率来评价抗炎一号细胞膜稳定作用,RBL-2H3细胞释放颗粒中的β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)与白细胞介素4(IL-4)分别用PNAG(ρ-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷,ρ-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)底物反应比色法与ELISA方法检测.结果抗炎一号能抑制RBL-2H3细胞释放β-氨基己糖苷酶与IL-4,药物浓度为8 μg/ml时即具有42.47％的脱颗粒抑制作用(P＜0.01),浓度增至80μg/ml、800μg/ml、8000 μg/ml时,抑制率分别为52.40％、68.26％、72.15％,对IL-4释放抑制作用分别为13.87％、23.27％、31.95％、39.99％.抗炎一号β-氨基己糖苷酶释放大抑制率为地塞米松大抑制率的84.48％,抑制IL-4作用与地塞米松相当.结论 抗炎一号具有肥大细胞膜稳定作用,故可干预Ⅰ型变态反应.
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致敏RBL-2H3细胞在清开灵、痰热清中药注射剂过敏性评价中的应用
目的 探索采用血清抗体致敏的RBL-2H3细胞对清开灵、痰热清2种中药注射剂过敏性进行初步评价.方法 以阳性药卵白蛋白(OVA)、清开灵注射液、痰热清注射液分别与Al(OH)3凝胶佐剂混合作为致敏源,Wistar大鼠sc致敏源制备抗体血清,采用放免法检测血清总IgE水平.取抗体血清致敏RBL-2H3细胞,48 h后再以药物激发致敏细胞,检测细胞脱颗粒后上清液中β-氨基己糖苷酶释放率.另取大鼠进行被动皮肤过敏(PCA)实验,观察动物皮肤蓝斑阳性反应率.结果 与对照组相比,OVA、清开灵、痰热清组大鼠抗体血清总IgE水平著显升高(P＜0.05、0.01).致敏细胞脱颗粒结果显示:采用OVA和清开灵、痰热清注射液抗体血清致敏细胞,再经药物激发后RBL-2H3细胞上清液中β-氨基己糖苷酶释放率明显增加(P＜0.05、0.01),与对照组比较,大的相对释放倍数分别为3.7、1.53、1.98.大鼠PCA实验结果显示,各给药组大鼠蓝斑阳性反应高百分率分别为100％、100％、86％.RBL-2H3细胞实验与PCA实验结果具有较好的一致性.结论 血清抗体致敏RBL-2H3细胞模型可以用于对中药注射剂过敏性的初筛或评价.
关键词： 致敏RBL-2H3细胞 清开灵注射液 痰热清注射液 过敏性 β-氨基己糖苷酶 -
清开灵注射液及其中间品类过敏反应的实验研究
目的:研究清开灵注射液及其生产过程中的中间品对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,评价清开灵注射液及其中间品的类过敏反应.方法:将清开灵注射液以5个不同浓度稀释,其中间品以IC50浓度稀释,分别作用于RBL-2H3细胞,45 min后,底物显色法测定β-氨基己糖苷酶释放度;ELISA法测定组胺释放量.结果:不同浓度的清开灵注射液对RBL-2H3细胞脱颗粒程度并无浓度依赖性,但高浓度下脱颗粒程度相对较高.同时,在其不同中间品中,金银花促进RBL-2H3细胞脱颗粒作用明显.结论:在体外,不同浓度的清开灵注射液均可不同程度的引起肥大细胞脱颗粒,释放活性物质,引起类过敏反应,而金银花可能是致敏的主要成分.本研究为进一步研究清开灵注射液不良反应的作用机制提供实验依据.
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中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的研究
目的:探讨中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒情况及其机制.方法:RBL-2H3细胞分别与阳性药物C48/80及15种中药注射剂作用,从形态学和超微结构观察、β-氨基己糖苷酶释放检测等方面研究RBL-2H3细胞脱颗粒情况.用WST-8法检测中药注射剂对RBL-2H3细胞和BRL细胞的细胞毒作用.结果:甲苯胺蓝染色和电镜观察细胞超微结构变化从形态学上证明中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒.上清中β-氨基己糖苷酶释放率检测表明脉络宁、清开灵、参麦和痰热清注射液明显促进酶的释放,酶释放率在20％以上,与阴性对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05).进一步的研究发现,痰热清注射液成分中的黄芩和生脉注射液成分中的红参、五味子与RBL-2H3细胞的脱颗粒有关.大部分中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的作用与细胞毒作用相关,但有的中药注射剂致脱颗粒无细胞毒作用.结论:一些中药注射剂可致RBL-2H3细胞脱颗粒,中药注射剂中有的成分与RBL-2H3细胞脱颗粒相关；有的中药注射剂致RBL-2 H3细胞脱颗粒与细胞毒作用有关,而pH和渗透压可影响细胞的脱颗粒.
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资木瓜乙酸乙酯萃取物对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
目的 研究资木瓜乙酸乙酯萃取物对不同抗原诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,并初步探讨其作用机制.方法 采用MTT法测定不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对细胞活性的影响,采用底物法检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对不同抗原引起的细胞内β-氨基己糖苷酶释放的影响,采用流式细胞分析仪检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对细胞表面受体FcεRIα表达的影响.结果 在一定浓度范围内,对细胞活性没有显著性影响的资木瓜乙酸乙酯萃取物可显著抑制细胞内β-氨基己糖苷酶的释放和降低细胞表面受体FcεRIα的表达,且呈量效关系.结论 资木瓜乙酸乙酯萃取物对RBL-2H3细胞脱颗粒具有显著的抑制作用,其作用可能与RBL-2H3细胞表面受体FcεRIα的表达降低有关.
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红花注射液致敏成分的RBL-2H3细胞模型筛选
目的 在红花注射液成分分离的基础上研究其引起过敏反应的主要成分.方法 化学萃取法、溶剂沉淀法将红花注射液分离为四种成分,用RBL-2H3细胞模型分别筛选四种组分的致敏作用.结果 红花注射液的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及红花注射液原液均能够引起RBL-2H3细胞显著脱颗粒、释放B-氨基己糖苷酶和组胺(P＜0.05),提示其致敏成分主要存在于上述提取物,其中以乙酸乙酯提取物致敏作用强(P＜0.01).结论 红花注射液中脂溶性较大的成分与过敏反应有密切联系,不同厂家、不同批次的红花注射液之间的致敏性差异仍需进一步研究.
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食物致敏性评价RBL-2H3细胞模型的研究
目的 研究大鼠嗜碱性白血病粒细胞(ra basophil leukemia cells,RBL-2H3细胞)用于食物致敏性评价的可行性.方法 实验组和对照组动物血清按照不同倍数稀释,包括1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256和1∶512,将稀释后的血清分别与RBL-2H3细胞孵育4h,然后用MEM完全培养基重新培养24 h.后,向细胞分别加入含有10 μg/ml和100 μg/ml OVA的MEM溶液,孵育45 min,测定上清液中β-氨基己糖苷酶含量和细胞内总的β-氨基己糖苷酶含量,计算β-氨基己糖苷酶释放率.结果 对比不同的蛋白刺激浓度发现:100 μg/ml OVA刺激后,稀释比例为1∶4、1∶8、1∶16和1∶32时,实验组和对照组差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);10 μg/ml OVA刺激后,稀释比例仅1∶4、1∶8和1∶16时,实验组和对照组差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).对比不同的血清稀释倍数发现,1∶4倍稀释时实验组β-氨基己糖苷酶释放率显著高于稀释比例1∶256实验组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 初步建立了RBL-2H3细胞致敏模型,以期用于食物致敏性评价中.
关键词： 大鼠嗜碱性白血病粒细胞 卵清蛋白 β-氨基己糖苷酶 释放率 -
几种常见中药注射剂对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
目的 通过研究几种常见中药注射剂(TCMI)对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,探讨RBL-2H3细胞模型应用于体外评价TCMI引起类过敏反应的可行性.方法 体外培养RBL-2H3细胞,血塞通等7种TCMI与其共同培养,通过中性红染色法计数脱颗粒的RBL-2H3细胞,显色法计算β-氨基己糖苷酶释放率,ELISA法检测培养上清中组胺含量,观察TCMI对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响.结果 正常RBL-2H3细胞出现少量脱颗粒现象,血塞通、清开灵、双黄连、脉络宁、香丹、穿琥宁等能显著引起细胞脱颗粒;血塞通、穿琥宁和柴胡注射液能不同程度促进β-氨基己糖苷酶的释放;血塞通、清开灵注射液可显著引起RBL-2H3细胞组胺释放.结论 RBL-2H3细胞脱颗粒的检测方法敏感、重复性好,其结果与临床报道有一定的相关性,提示其有评价TCMI所致的类过敏反应的潜在应用价值.
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青藤碱对大鼠肥大细胞RBL－2H3活化的影响及机制
目的：探讨青藤碱对大鼠肥大细胞RBL－2H3活化的影响及其作用机制。方法将培养的大鼠RBL－2H3细胞随机分为对照Ⅰ组和青藤碱组。青藤碱组用青藤碱溶液处理，对照Ⅰ组则用PBS处理。利用生化法检测两组细胞培养上清中β－氨基己糖苷酶释放率，并用荧光定量PCR和Western blot方法检测细胞中信号调节蛋白α（SIRPα）mRNA和蛋白的表达水平。构建SIRPα过表达重组质粒或SIRPαsiRNA，将RBL－2H3细胞分为对照Ⅱ组、空载质粒组、过表达组、对照Ⅲ组、空白组、沉默组，对照Ⅱ组和对照Ⅲ组不进行转染，空载质粒组转染空白质粒，过表达组转染SIRPα过表达质粒，空白组转染非特异性siRNA，沉默组转染SIRPαsiRNA，转染结束后向对照Ⅲ组、空白组、沉默组添加青藤碱处理，并检测SIRPα的表达及炎症因子白细胞介素（ IL）－4、IL－6和肿瘤坏死因子－α（ TNF－α）的含量。结果与对照Ⅰ组比较，青藤碱组细胞中β－氨基己糖苷酶释放率显著降低（P＝0．000），SIRPαmRNA及蛋白表达量均显著升高（P＝0．000）。与对照Ⅱ组和空载质粒组比较，过表达组细胞中SIRPαmRNA表达量显著升高（P＝0．000），IL－4、IL－6和TNF－α含量均明显降低（P＝0．000）。与对照Ⅲ组和空白组比较，沉默组细胞SIRPαmRNA表达量显著降低（P＝0．000），IL－4、IL－6和TNF－α含量均显著升高（ P＝0．000）。结论青藤碱处理能够显著抑制大鼠RBL－2H3细胞活化并上调细胞中SIRPα基因的表达，而SIRPα基因介导了青藤碱的这种抑制作用。
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SELEX技术筛选钙通道特异性核酸适配体及其抗肥大细胞活化的作用
目的 筛选针对Orai1分子第1膜外区蛋白的核酸适配体,探讨适配体通过拮抗钙离子释放激活通道(Ca2+ release activation channel,CRAC)抑制肥大细胞活化的效应.方法 构建随机单链DNA文库,利用不对称PCR对单链DNA文库进行扩增.采用聚苯乙烯酶联板为介质的指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术筛选核酸适配体.利用酶联免疫吸附实验检测各轮筛选序列与靶蛋白的亲和力,验证适配体与靶蛋白的特异性结合；激光共聚焦显微镜观察适配体对细胞内钙离子浓度变化的影响；利用IgE介导的肥大细胞脱颗粒模型,观察适配体对β-氨基己糖苷酶释放的抑制效应.结果 经过12轮SELEX筛选,获得了7条核酸适配体,其中AptamerY1解离常数(Kd值)为1.72×10-8 mol/L.以终浓度2μg/mL的AptamerY1可抑制由IgE介导的人肥大细胞系LAD2钙离子内流,并对LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放抑制率达95％.结论 通过SELEX筛选,获得了7条针对Orai1分子第1膜外区的核酸适配体,所获得适配体可对肥大细胞LAD2钙内流有效抑制,进而抑制肥大细胞活化和β-氨基己糖苷酶的释放.
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大气细颗粒物(PM2.5)对肥大细胞分泌β-氨基己糖苷酶、组胺和IL-4的影响
目的 探究大气细颗粒物(PM2.5)对肥大细胞的生物学效应.方法 采用智能中流量空气总悬浮微粒采样器采集重庆市内非工业区空气中PM2.5,以不同浓度(0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0 μg/mL) PM2.5混0悬液作用于人肥大细胞系LAD2,采用微板法检测LAD2细胞β-氨基己糖苷酶的释放水平;采用ELISA法检测LAD2细胞释放组胺、白细胞介素4(interleukiin-4,IL-4)以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平.结果 终浓度为25.0 μg/mL的PM2.5刺激后,LAD2细胞分泌并释放人细胞上清的β-氨基己糖苷酶、组胺及IL-4的水平高于0μg/mL PM2.5组[(23.78±3.98)％ vs (14.05±1.12)％,(12.32 ±0.18)vs(9.72 ±0.23) μg/mL,(267.63 ±7.97)vs (154.25±7.71) pg/mL,P＜0.01];12.5 ～ 100.0μg/mL PM2.5刺激后,LAD2细胞产生ROS水平逐渐升高,终浓度为25.0 μg/mL的PM2.5刺激LAD2细胞后产生的ROS水平高于0μg/mL PM2.5组[(7.99 ±0.29)vs(5.88 ±0.49) ng/mL,P＜0.01].结论 PM2.5可能通过氧化应激致使肥大细胞产生ROS,引起肥大细胞产生细胞因子和炎症因子.
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GM2神经节苷脂沉积症发病的分子机理研究
目的探讨GM2神经节苷脂沉积症发病的分子机理.方法培养患者皮肤成纤维细胞,进行酶学、Western 印迹杂交和免疫细胞化学分析.结果 4例GM2神经节苷脂沉积症患者成纤维细胞内β-氨基己糖苷酶(hexosaminidase, Hex)活性均显著降低,分别为正常人的12%、3%、15%和6%;两例Sandhoff 病Hex成熟的α、β-亚基(αm、βm)明显减少,但婴儿型与成年型减少的程度不同,1例Tay-Sachs病只有αm明显减少,1例GM2激活蛋白缺陷症αm、βm与正常人无差异;4例患者成纤维细胞内均有不同程度的GM2神经节苷脂的堆积.结论 GM2神经节苷脂沉积症的发病与HEXA、HEXB、GM2A基因突变引起相应蛋白表达、成熟障碍有关.
关键词： GM2神经节苷脂沉积症 β-氨基己糖苷酶 亚基 -
莽草酸抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒和组胺释放
目的 研究莽草酸对大鼠RBL-2H3细胞增殖和化合物48/80(C48/80)诱导后细胞脱颗粒情况及其机制.方法 MTT法检测(3、10、30) μg/mL的莽草酸处理后,RBL-2H3细胞的增殖情况,甲苯胺蓝染色观察C48/80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒的情况,底物法检测(0、12.5、25、50、80、100) μg/mL C48/80处理后,RBL-2H3细胞内β-氨基己糖苷酶的释放,ELISA检测各处理组细胞上清液中组胺的含量.结果 (3、10、30)μg/mL莽草酸对RBL-2H3细胞增殖无明显抑制作用,RBL-2H3细胞脱颗粒与C48/80的剂量有一定量效关系;莽草酸能抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒;与阳性对照组相比,莽草酸处理C48/80刺激后的RBL-2H3细胞,其β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放量均显著降低.结论 莽草酸可抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒,减少组胺释放.
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聚山梨酯80对多源肥大细胞脱颗粒的影响研究
目的 通过比较不同浓度聚山梨酯80溶液对RBL-2H3、P815、Ku812细胞脱颗粒的影响,探究聚山梨酯80的量与过敏反应的关系,进而筛选出一套灵敏、稳定的体外肥大细胞脱颗粒模型.方法 体外培养RBL-2H3、P815和Ku812细胞,测定3株细胞的生长曲线,在细胞生长对数期,以不同浓度(0.04、0.20、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 mg/mL)聚山梨酯80分别刺激3株细胞,采用中性红染色法显微镜下观察不同浓度聚山梨酯80溶液对3株细胞脱颗粒的影响,并计算脱颗粒百分率,同时以化学发光法分别检测组胺和β-氨基己糖苷酶释放率,以酶联免疫吸附法测定类胰蛋白酶的释放量;并进一步检测聚山梨酯80对人的肥大细胞IgE释放的影响.结果 3株肥大细胞脱颗粒模型中,各细胞的脱颗粒指标均随聚山梨酯80浓度的升高而升高.相同浓度聚山梨酯80对人源、大鼠、小鼠肥大细胞的类胰蛋白酶释放量无较大统计学差异;与RBL-2H3细胞系比较,P815细胞和组胺释放率显著降低(P＜0.05、0.01),Ku812细胞组胺释放率和β-氨基己糖苷酶释放率显著升高(P＜0.05、0.01),Ku812细胞脱颗粒灵敏.但在实验过程中发现Ku812细胞模型稳定性、可重复性较差,而RBL-2H3细胞稳定性、可重复性均优于Ku812和P815细胞.0.04～80.00 mg/mL的聚山梨酯80溶液作用于Ku812细胞产生的IgE均低于检测限.结论 聚山梨酯80诱导的过敏反应可能是不经过IgE介导的类过敏反应,随着聚山梨酯80浓度的增大,3个细胞模型脱颗粒现象显著,相比于Ku812和P815细胞,RBL-2H3细胞更适合作为体外肥大细胞脱颗粒检测模型.
