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小金胶囊药材组分过敏性研究
目的：探讨小金胶囊主要药材组分的过敏性。方法：实验分为12组，包括空白对照组、阳性对照组和10组不同药材组，通过灌胃方式对大鼠给药，隔天1次，15 d后取抗血清，对RBL-2 H3细胞进行培养，进行抗原攻击后，检测培养液中组胺和β-氨基己糖苷酶的释放量。结果：制木鳖子组的细胞组胺释放量明显高于空白对照组（P＜0.05），人工麝香组、制木鳖子组和乳没组的细胞β-氨基己糖苷酶释放量明显高于空白对照组，但自制木鳖子组和制乳没组的细胞组胺和β-氨基己糖苷酶释放量与空白对照组差异无统计学意义。结论：小金胶囊致敏药材可能为人工麝香、木鳖子和乳没，经适当方法炮制可降低其致敏性。
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射干抗病毒注射液致类过敏反应初步研究
目的:探究射干抗病毒注射液的致类过敏反应及其可能的作用机制.方法:通过体外动物类过敏试验,探究射干抗病毒注射液对小鼠耳廓血管通透性的影响;细胞水平上,采用MTT比色法筛选出射干抗病毒注射液对RBL-2H3细胞的安全作用浓度,并在安全浓度之下,以不同浓度,用中性红染色观察其脱颗粒状态,检测射干抗病毒注射液对细胞内颗粒物质β-氨基己糖苷酶释放量的影响,Fluo-3荧光标记细胞内Ca2检测细胞内钙离子变化,综合考察射干抗病毒注射液的体外致类过敏性.结果:射干抗病毒注射液可引起小鼠耳廓通透性增强,引发类过敏反应;并可诱导RBL-2H3细胞发生脱颗粒反应,使胞内钙离子浓度升高,且均具有剂量依赖性.结论:射干抗病毒注射液具有引发类过敏反应的风险,其机制可能与引起胞内Ca2+浓度增加有关.
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大鼠腹腔肥大细胞与RBL-2H3细胞脱颗粒方法的建立及其在中药注射剂安全性评价上的应用
目的:建立大鼠体外肥大细胞以及RBL-2H3细胞脱颗粒试验的方法,评估2种细胞脱颗粒方法对中药注射剂(traditional Chinese medicine injections,TCMI)引起脱颗粒的可行性.方法:提取大鼠腹腔肥大细胞(rat peritoneal mast cell,RPMC),优化实验条件,用阳性药物C48/80和各种TCMI等与其共培养,通过甲苯胺蓝染色法计数腹腔MC脱颗粒率；通过RBL-2H3细胞与TCMI共同培养,底物显色法检测β-氨基己糖苷酶释放率.结果:阳性对照品C48/80的浓度与RPMC脱颗粒有一定的量效关系；参麦、冠心宁、痰热清、清开灵和生脉5种TCMI能显著引起细胞脱颗粒,并与药物浓度有一定的正相关性；RBL-2H3细胞脱颗粒方法中参麦、黄芪、银杏、痰热清、丹香冠心、清开灵和生脉7种TCMI能是β-氨基己糖苷酶释放率升高.结论:一些TCMI能引起体外RPMC和RBL-2H3细胞脱颗粒,2种细胞脱颗粒方法在评价一些TCMI可能引起类过敏反应方面具有一定的互补性与可行性.
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脉络宁针剂致敏RBL-2H3细胞的实验研究
目的:通过研究临床含有绿原酸的中药注射剂脉络宁针剂对RBL-2H3细胞(大鼠嗜碱性白血病细胞系)脱颗粒、释放介质的影响,探讨绿原酸与中药注射剂发生严重过敏反应的关系,为临床安全用药提供依据.方法:以含有绿原酸的中药针剂脉络宁为研究对象,以不含绿原酸的葛根素针剂为阴性对照,以绿原酸对照品为阳性对照,通过对体外培养RBL-2H3细胞模型的作用,观察该细胞模型发生脱颗粒反应和细胞形态变化,检测β-己糖胺酶释放量.结果:脉络宁、绿原酸组可显著引起RBL-2H3细胞释放β-己糖胺酶(P＜0.05)；葛根素注射液组能不同程度促进β-己糖胺酶的释放.结论:脉络宁组可显著引起RBL-2H3细胞释放β-己糖胺酶,提示绿原酸与中药注射剂脉络宁发生严重过敏反应有密切关系.
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清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞增殖的影响
目的:研究不同浓度的清开灵注射液及其生产过程中的中间品对RBL-2H3细胞增殖的影响,建立相应类过敏细胞模型及利用该模型评价清开灵注射液及其中间品的不良反应,进而为全流程监控药品质量奠定基础.方法:将清开灵注射液及其中间品分别以体积比1/4为初始浓度,2倍稀释至1/4 096,共11个浓度作用于RBL-2H3细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态,用四甲基偶氮唑盐法测定不同浓度清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞生长的抑制作用,并计算细胞增殖的半数抑制浓度(IC50).结果:较低浓度的清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞生长有轻度促进作用,随着药液浓度的增加,对RBL-2H3细胞生长的抑制作用逐渐明显,细胞存活率显著降低(P＜0.05),到1/4浓度时,抑制率接近100％.结论:测定并计算清开灵各中间品的IC50,可用于进一步建立相应类过敏细胞模型,评价清开灵注射液及其中间品的不良反应及全流程的监控药品质量.
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绿原酸对RBL-2H3细胞脱颗粒作用的研究
目的:通过比较绿原酸和绿原酸完全抗原对未致敏和致敏RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,探讨绿原酸的致敏性及其作用机制,为进一步正确评价绿原酸在中药注射剂不良反应中地位和临床合理用药提供一定的参考.方法:采用未致敏RBL-2H3细胞和致敏RBL-2H3细胞模型,观察绿原酸和绿原酸完全抗原对肥大细胞脱颗粒的影响.比色法检测过敏介质组胺和β-氨基己糖苷酶的释放,中性红染色法进行形态学观察,流式细胞法检测 Annexin V阳性细胞率.结果:绿原酸和绿原酸完全抗原直接刺激RBL-2H3细胞并未引起肥大细胞发生脱颗粒反应;将RBL-2H3细胞与绿原酸或双黄连致敏血清共孵育致敏后,绿原酸完全抗原再次作用于细胞,可引起细胞组胺释放率、β-氨基己糖苷酶释放率、Annexin V阳性细胞率和中性红染色脱颗粒细胞率均明显增加.结论:绿原酸作为小分子物质,以半抗原形式存在,本身不具有致敏性,但它能与血清蛋白结合形成复合物而产生免疫原性,从而引起过敏反应.绿原酸作为双黄连注射剂的一种有效成分,同时也是双黄连注射剂引起变态反应的一种致敏原.
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羧胺三唑对RBL-2H3细胞活化脱颗粒的影响
目的研究羧胺三唑(CAI)对RBL-2H3肥大细胞增殖、凋亡及活化脱颗粒的影响,探索CAI的抗感染作用机制.方法以C48/80诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒模型,中性红染色法观察细胞脱颗粒的形态学,分别用ELISA法和底物显色法检测细胞培养上清中组胺和β-氨基己糖苷酶的释放水平,CCK-8法测定细胞活力,Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡.结果与对照组相比,10、20和40 μmol/L CAI能够不同程度抑制C48/80诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒反应,20和40 μmol/L CAI能够降低C48/80诱导的组胺释放(P<0.01),40 μmol/L CAI能够降低β-氨基己糖苷酶的释放(P<0.01).另外,所用各浓度的CAI对细胞增殖和凋亡均无明显影响.结论CAI能有效抑制RBL-2H3肥大细胞的活化脱颗粒,此作用并不是通过细胞毒发挥作用的.CAI可能部分通过下调肥大细胞的功能活化,发挥其抗感染作用.
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类过敏反应体外评价模型的建立及其指标的筛选
目的:以C48/80为阳性药物,比较3种细胞系(RBL-2H3,P8l5和Ku812细胞)及其指标在评价药物类过敏中的敏感性;并采用聚山梨酯80对3种细胞模型评价类过敏反应的适用性进行考察.方法:以不同浓度的C48/80分别作用于3种细胞系30和60 min,测定β-氨基糖苷酶释放率、Annexin V阳性细胞率以及IL-4和TNF-α释放量.然后,用聚山梨酯80进行模型的适用性考察,同时对不同浓度的聚山梨酯80引起的类过敏反应进行评价.结果:C48/80可引起3种细胞系的β-氨基糖苷酶释放率、AnnexinV阳性细胞率、IL-4释放量和TNF-α释放量呈剂量依赖性增加;除了RBL-2H3细胞,其他2个细胞系检测到的IL-4释放量非常少,且3种细胞系检测到的TNF-a量亦非常少;AnnexinV阳性细胞率的增加程度较其他3项指标明显;在相同刺激条件下,P815和Ku812细胞的β-氨基糖苷酶释放率和AnnexinV阳性细胞率的突增较RBL-2H3细胞发生时间早,突增效果更明显.聚山梨酯80的结果与C48/80给药时基本吻合.此外,还发现聚山梨酯80≥0.05 mg·mL-1时,即存在引起类过敏反应的风险.结论:β-氨基己糖苷酶释放率和AnnexinV阳性细胞率是评价类过敏反应的2种稳定、可靠、重复性好的检测指标;IL-4释放量和TNF-α释放量较适合作为辅助检测指标;AnnexinV阳性率可较敏感地、较早地提示类过敏反应的发生.P815和Ku812细胞较RBL-2H3细胞更适合作为一种早期、稳定、敏感的肥大细胞脱颗粒体外检测模型,用于致类过敏反应药物的早期筛选.
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脂微球替代增溶剂消除维生素K1注射液的严重不良反应
目的 维生素K1注射液产生的类过敏反应是其严重的不良反应,本实验拟用脂微球替代增溶剂的维生素K1脂微球以消除类过敏反应.方法 Beagle犬分别静脉注射维生素K1脂微球和维生素K1注射液,比较行为学、血压、血浆IgE、组胺等指标的变化.用分光光度法和流式细胞术检测RBL-2H3细胞的脱颗粒及细胞凋亡.结果 维生素K1注射液能诱发犬Ⅳ级及以上类过敏症状,评分(16.8±1.6)(P＜0.01),血浆组胺升高(P＜0.05),血压下降(P＜0.01).维生素K1注射液可以诱导RBL-2H3细胞释放组胺和β-氨基己糖苷酶,导致细胞凋亡.而维生素K1脂微球不引起犬发生异常行为,不升高血浆组胺,不引起RBL-2H3细胞释放颗粒和细胞凋亡.维生素K1注射液和维生素K1脂微球组血浆IgE均无明显变化.结论 维生素K1注射液能够引起类过敏反应,而不引起过敏.维生素K1脂微球既不引起类过敏反应也不引起过敏反应.
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清开灵注射液致RBL-2H3细胞脱颗粒过程与钙离子相关性研究
目的 探讨清开灵注射液致RBL-2H3细胞脱颗粒与钙离子的相关性.方法 选取RBL-2H3细胞系为研究对象,实验设正常组、阳性对照组和药物处理组,采用MTT比色法确定清开灵注射液IC50;配制一定浓度的清开灵注射液并与细胞孵育30 min后,采用流式细胞术测定细胞脱颗粒率和细胞内钙离子荧光强度的变化;采用激光扫描共聚焦显微镜技术检测细胞内钙离子荧光强度以及细胞骨架的变化.结果 剂量为40 mL/L的清开灵注射液可引起RBL-2H3细胞脱颗粒,同时伴随细胞内钙离子荧光强度增加,细胞骨架发生变化.结论 清开灵注射液致RBL-2H3细胞脱颗粒过程与钙离子相关.
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体外检测RBL-2H3细胞脱颗粒方法的研究进展
嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3细胞)属于大鼠嗜碱粒细胞肿瘤株的一个亚系,1978年美国国立研究所从Wistar大鼠嗜碱性白血病细胞株反复克隆获得的[1-2].RBL-2H3细胞具有肥大细胞的生物学特性,能模拟肥大细胞的多种功能,是体外研究与肥大细胞相关的各种药物作用机制的重要模型.笔者阐述了RBL-2H3细胞作为体外模型用于检测脱颗粒的不同检测方法.
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大鼠RBL-2H3细胞瞬时感受器电位M7通道参与细胞存活及凋亡
背景:瞬时感受器电位M7是肥大细胞上重要的钙离子通道,但其在肥大细胞存活及凋亡过程中的作用仍未明确.目的:观察瞬时感受器电位M7通道对大鼠RBL-2H3细胞存活及凋亡的影响.方法:取对数生长期RBL-2H3细胞,①分别以50,100,200 μmol/L瞬时感受器电位通道阻断剂2-APB进行干预,并以0.1%DMSO干预的细胞及正常培养的细胞作对照.②以瞬时感受器电位M7-siRNA反转录病毒载体转染RBL-2H3细胞,并设立空载体组和正常对照组.结果与结论:经过100,200 μmol/L的2-APB作用72 h后,RBL-2H3细胞数减少,吸光度值降低(P < 0.05),细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加(P < 0.05);RBL-2H3细胞转染si-瞬时感受器电位M7 72 h 后,吸光度值降低(P < 0.05),细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加(P < 0.05).说明瞬时感受器电位M7通道参与了RBL-2H3细胞存活和凋亡过程.
关键词： 瞬时感受器电位M7通道 RBL-2H3细胞 RNA干扰 反转录病毒 凋亡 -
双黄连注射液中8种主要成分对RBL-2H3细胞的影响
目的 以双黄连注射液为研究对象,探讨其中8种主要成分的致敏性.方法 采用RBL-2H3细胞模型,分别用双黄连注射液、黄芩苷、黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸处理细胞,测定细胞脱颗粒率以及β-氨基己糖苷酶和5-羟色胺的释放率.结果 双黄连注射液、绿原酸及隐绿原酸能直接引起RBL-2H3细胞脱颗粒,并能显著提高细胞内β-氨基己糖苷酶和5-羟色胺的释放,其他成分无显著的致敏性.结论 双黄连注射液的致敏性可能是由绿原酸和隐绿原酸引起的.
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RBL-2H3细胞评价血塞通注射剂致敏模型建立
目的 建立佳血塞通注射液致RBL-2H3细胞过敏介质释放评价模型.方法 分别从细胞破坏法、渗透压、细胞体积、反应时间以及底物浓度等方面考察确定组胺和己糖胺酶反应体系,并对96孔板和24孔板进行方法学考察.结果 冻融法无法完全破坏细胞,0.1％ Triton X-100被认为是佳的细胞破碎方法.反应时间为30 min,样品含水量需在80％以下.终确定组胺和己糖胺酶的佳反应体系,96孔板和24孔板标准偏差均小于15％,24孔板精密度和重复性稍高于96孔板.结论 建立了RBL-2H3细胞评价血塞通注射剂致敏性模型.96孔板和24孔板均可作为评价血塞通注射剂致RBL-2H3细胞过敏指标释放的载体.
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中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的研究
目的:探讨中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒情况及其机制.方法:RBL-2H3细胞分别与阳性药物C48/80及15种中药注射剂作用,从形态学和超微结构观察、β-氨基己糖苷酶释放检测等方面研究RBL-2H3细胞脱颗粒情况.用WST-8法检测中药注射剂对RBL-2H3细胞和BRL细胞的细胞毒作用.结果:甲苯胺蓝染色和电镜观察细胞超微结构变化从形态学上证明中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒.上清中β-氨基己糖苷酶释放率检测表明脉络宁、清开灵、参麦和痰热清注射液明显促进酶的释放,酶释放率在20％以上,与阴性对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05).进一步的研究发现,痰热清注射液成分中的黄芩和生脉注射液成分中的红参、五味子与RBL-2H3细胞的脱颗粒有关.大部分中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的作用与细胞毒作用相关,但有的中药注射剂致脱颗粒无细胞毒作用.结论:一些中药注射剂可致RBL-2H3细胞脱颗粒,中药注射剂中有的成分与RBL-2H3细胞脱颗粒相关；有的中药注射剂致RBL-2 H3细胞脱颗粒与细胞毒作用有关,而pH和渗透压可影响细胞的脱颗粒.
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药用注射辅料聚山梨酯80诱发类过敏反应的细胞研究
目的:观察聚山梨酯80诱导大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞株RBL 2H3细胞脱颗粒现象,探讨其诱发类过敏反应的可能机制.方法:聚山梨酯80与RBL-2H3细胞共同孵育60 min后,透射电镜观察细胞发生脱颗粒反应的形态学变化,荧光显微镜下观察细胞膜磷脂酰丝氨酸与Annexin V结合变化,分光光度法测定细胞上清液β-氨基己糖苷酶释放百分率,并通过阿利新蓝染色试验进行定性观察.结果:不同浓度聚山梨酯80可诱导细胞发生典型的脱颗粒反应形态学变化,与阴性对照组相比脱颗粒率及组胺释放率显著升高,且具有浓度依赖性.结论:聚山梨酯80单次、首次给药即可诱导RBL-2H3细胞脱颗粒,释放组胺,诱发类过敏反应,这可能是其临床首次用药即引起严重不良反应的机制之一.
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非免疫性过敏反应细胞模型的建立
目的:通过非免疫性刺激物C48/80诱导大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞株RBL-2H3细胞脱颗粒反应正交试验,优化非免疫性过敏反应细胞模型建立条件.方法:在不同的孵育时间下,C48/80与不同浓度的RBL-2H3细胞共孵育,通过测定β-氨基己糖苷酶的释放率确定建立非免疫型过敏反应细胞模型的优实验条件,并且分析不同检测方法间的差异.结果:不同浓度、不同孵育时间下的RBL-2H3细胞均可受C48/80诱导发生典型的脱颗粒反应,但不同条件下的脱颗粒程度和β-氨基己糖苷酶释放率都有显著差异.结论:当RBL-2H3细胞浓度为2×105 mL、孵育时间60 min时,细胞的感受性较好,其脱颗粒程度与药物浓度呈正相关.
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虾原肌球蛋白及其IgE单克隆抗体建立I型过敏反应体内外模型
目的：利用虾原肌球蛋白及其IgE单克隆抗体建立I型过敏反应体内外模型。方法采用等电点沉淀法制备刀额新对虾原肌球蛋白，利用杂交瘤技术制备抗虾原肌球蛋白IgE单克隆抗体。建立虾原肌球蛋白攻击 IgE单抗致敏的RBL-2H3细胞模型，测定β-氨基己糖苷酶释放量。利用虾原肌球蛋白及其IgE单抗建立被动全身过敏反应小鼠模型，监测抗原攻击后30 min内肛温的变化。结果 IgE单抗致敏的RBL-2H3细胞在虾原肌球蛋白攻击后发生脱颗粒，β-氨基己糖苷酶释放量明显增加。虾原肌球蛋白及其IgE单抗诱导了小鼠被动全身过敏反应，抗原攻击后小鼠肛温平均下降约1．44℃。结论虾原肌球蛋白及其IgE单克隆抗体成功建立了I型过敏反应体内外模型。
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氧化苦参碱对RBL-2H3肥大细胞活化脱颗粒的影响
目的:探讨氧化苦参碱的抗Ⅰ型变态反应的作用机制.方法:用MTT比色法检测不同浓度的氧化苦参碱对RBL-2H3细胞活化的影响.根据MTT比色法分别选择氧化苦参碱5个不同的实验浓度,并以色甘酸钠作为阳性对照.以C48/80刺激RBL-2H3细胞活化脱颗粒,测不同浓度药物对RBL-2H3细胞分泌组胺及TNF-α变化.结果:氧化苦参碱对RBL-2H3细胞的增殖有抑制作用.氧化苦参碱能抑制RBL-2H3细胞释放组胺及TNF-α,抑制作用不弱于色甘酸钠组.氧化苦参碱浓度的对数与RBL-2H3细胞释放组胺和TNF-α抑制率呈高度线性关系.结论:氧化苦参碱能抑制RBL-2H3细胞分泌组胺和TNF-α,该抑制作用呈剂量依赖性.其治疗Ⅰ型变态反应性皮肤病可能和它抑制肥大细胞活化脱颗粒有关.
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资木瓜乙酸乙酯萃取物对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
目的 研究资木瓜乙酸乙酯萃取物对不同抗原诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,并初步探讨其作用机制.方法 采用MTT法测定不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对细胞活性的影响,采用底物法检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对不同抗原引起的细胞内β-氨基己糖苷酶释放的影响,采用流式细胞分析仪检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对细胞表面受体FcεRIα表达的影响.结果 在一定浓度范围内,对细胞活性没有显著性影响的资木瓜乙酸乙酯萃取物可显著抑制细胞内β-氨基己糖苷酶的释放和降低细胞表面受体FcεRIα的表达,且呈量效关系.结论 资木瓜乙酸乙酯萃取物对RBL-2H3细胞脱颗粒具有显著的抑制作用,其作用可能与RBL-2H3细胞表面受体FcεRIα的表达降低有关.
