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瑶药定心藤挥发油对肺腺癌细胞和肝癌细胞的抑制活性研究
目的 探讨瑶药定心藤挥发油对肺腺癌细胞(SPC-A-1)、肝癌细胞(BEL-7402)的抑制作用.方法 超临界CO2法提取挥发油,以半数抑制浓度(IC50)为评价抗肿瘤活性强度的指标,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)观察定心藤挥发油对肿瘤细胞的抑制作用.结果 定心藤挥发油在浓度为200 μg/ml时,其抑制率均＞50％,IC5o分别为169.54、695.21 μg/ml.结论 瑶药定心藤超临界CO2提取挥发油对两种肿瘤细胞均有抑制作用.
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清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞增殖的影响
目的:研究不同浓度的清开灵注射液及其生产过程中的中间品对RBL-2H3细胞增殖的影响,建立相应类过敏细胞模型及利用该模型评价清开灵注射液及其中间品的不良反应,进而为全流程监控药品质量奠定基础.方法:将清开灵注射液及其中间品分别以体积比1/4为初始浓度,2倍稀释至1/4 096,共11个浓度作用于RBL-2H3细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态,用四甲基偶氮唑盐法测定不同浓度清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞生长的抑制作用,并计算细胞增殖的半数抑制浓度(IC50).结果:较低浓度的清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞生长有轻度促进作用,随着药液浓度的增加,对RBL-2H3细胞生长的抑制作用逐渐明显,细胞存活率显著降低(P＜0.05),到1/4浓度时,抑制率接近100％.结论:测定并计算清开灵各中间品的IC50,可用于进一步建立相应类过敏细胞模型,评价清开灵注射液及其中间品的不良反应及全流程的监控药品质量.
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白芍总苷对人膝骨关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响
目的:研究不同浓度的白芍总苷在不同时间干预下对人膝关节骨性关节炎滑膜成纤维细胞增殖活性的影响,探讨时间与浓度的变化规律和对滑膜炎症反应的作用.方法:膝关节置换术中取得新鲜滑膜组织经胶原酶法分离培养,于倒置显微镜下观察细胞形态;将白芍总苷以1mg/mL为初始浓度,4倍稀释成11个浓度依次作用于滑膜成纤维细胞,用四甲基偶氮唑盐法分别测定不同浓度的白芍总苷在24、48、72h干预后对滑膜成纤维细胞增殖水平的影响,并计算生长抑制率和存活分数.结果:经24、48、72h的干预后,低浓度的白芍总苷对人膝关节骨性关节炎滑膜成纤维细胞生长有轻度促进作用,中高浓度(＞15.625μg/mL)则有显著的抑制作用(P＜0.05),且呈时间和浓度依赖性.结论:四甲基偶氮唑盐实验可用于评价白芍总苷对滑膜成纤维细胞增殖活性的影响;测定并计算各生长抑制率和存活分数,探讨中药有效成分与细胞增殖活性的关系,为进一步明确其药理作用机制、建立相应滑膜炎症反应细胞模型、探寻针对骨性关节炎各环节的靶向治疗提供实验参数.
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RNA干扰沉默Aurora A基因表达对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨RNA干扰技术抑制人胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞增殖及凋亡的影响. 方法 设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blotting检测Aurora A mRNA和蛋白的表达情况,同时利用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验和流式细胞仪观察转染后U251细胞增殖抑制率和细胞凋亡,透射电镜观察细胞凋亡超微结构改变. 结果 转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低;U251细胞增殖的抑制率和细胞凋亡率显著增高 (P<0.01),且U251细胞发生了显著的凋亡形态改变. 结论 体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功地抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡,提示Aurora A可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点.
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人参皂苷Rg1诱导人白血病K562细胞复制性衰老的机制
目的 探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化.方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老.流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测复制性衰老信号通路相关P21、P53与Rb蛋白表达;透射电镜观察人白血病K562细胞衰老超微形态学改变.结果 Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,其佳作用浓度为20 μmol/L,时间为48h;诱导后的K562细胞阻滞于G2/M期;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加(P<0.05);复制性衰老通路相关蛋白P21、P53和Rb表达上调(P<0.05);端粒长度缩短加速(P<0.05);经诱导细胞呈现胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大等衰老形态学变化.结论 Rg1可能经由p53-p21-Rb信号通路诱导K562细胞呈现复制性衰老特征.
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TWEAK反义寡核苷酸对人结肠癌细胞系SW480增殖及侵袭能力的影响
目的 观察肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)对人结肠癌细胞系SW480增殖及侵袭能力的影响.方法 合成TWEAK反义寡核苷酸(ASODN)、错义寡核苷酸(SCODN)后转染人结肠癌细胞系SW480,将细胞分为空白对照组、脂质体(LF)对照组、ASODN组、SCODN组;采用MTT法检测肿瘤细胞增殖抑制情况,流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞周期分布,ELISA法检测细胞培养液上清中可溶性TWEAK及其受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(Fn14)的表达,Western blotting法、免疫荧光细胞化学法(IF)检测细胞中的TWEAK及Fn14蛋白的表达,运用Transwell侵袭实验观测结肠癌细胞侵袭能力的变化.结果 空白对照组、LF对照组、SCODN组之间结肠癌细胞的增殖情况无明显差异(P＞0.05),与对照组相比ASODN组肿瘤细胞增殖受到明显抑制(P＜0.05),且呈剂量-时间依赖关系;转染TWEAK ASODN后,G2+M期细胞比例明显高于对照组(P＜0.05),TWEAK及其受体Fn14在结肠癌细胞培养液及细胞内的表达均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);转染TWEAK ASODN后肿瘤细胞侵袭抑制率为31.39％,明显高于对照组(P ＜0.05);TWEAK及其受体Fn14在结肠癌细胞培养液及细胞内的表达均密切相关(P＜0.05).结论 TWEAK ASODN可能通过抑制TWEAK与其受体Fn14结合干扰肿瘤的发生发展,抑制TWEAK表达能抑制人结肠癌细胞系SW480的增殖与侵袭.
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环氧合酶2抑制剂的抗胰腺癌作用及相关机制
目的 探讨环氧合酶2(COX-2)抑制剂对胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力和对COX-2、基质金属蛋白酶(MMP)-14蛋白表达的影响以及可能的抗胰腺癌机制.方法 不同浓度的COX-2抑制剂塞来昔布(20、60、100μmol/L)处理胰腺癌细胞后,用MTT比色法检测细胞的增殖能力;用Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞的侵袭能力和迁移能力;ELISA检测MMP-14和COX-2的蛋白表达情况.结果 MTT增殖实验、Transwell侵袭实验、划痕实验分别提示,COX-2抑制剂作用后胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力均以浓度梯度形式下降(P＜0.05);ELISA结果显示,胰腺癌细胞中COX-2和MMP-14的蛋白表达水平相应降低(P＜0.05),两者表达具有显著正相关性(r =0.873,P＜0.05).结论 COX-2抑制剂可能通过抑制COX-2表达下调MMP-14表达,进而以浓度梯度形式减弱胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力,起到抗胰腺癌作用.
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油樟叶挥发油及其主要成分的体外抗肝癌活性
目的 探讨油樟叶挥发油及其主要组成成分(1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油烯、α-松油烯和松油烯-4-醇)的抗肝癌活性. 方法 运用体外培养细胞四甲基偶氮唑盐(MTT)快速比色法,观察油樟叶挥发油的主要组成成分(1,8-桉叶油素、黄樟油素、α-松油烯、松油烯-4-醇和γ-松油烯)对人肝癌BEL-7402细胞的抑制作用,并用软琼脂细胞集落形成实验,观察油樟叶挥发油的主要组成成分对人肝癌BEL-7402细胞形成细胞集落的抑制作用. 结果 油樟叶挥发油、1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油烯、α-松油烯和松油烯-4-醇体外对人肝癌BEL-7402细胞的大增殖抑制率分别为58.63％、42.83％、90.04％、81.53％、34.83％和31.46％；对人肝癌BEL-7402细胞集落形成的大抑制率分别为55.13％、61.99％、94.56％、89.54％、62.02％和59.91％. 结论 油樟叶挥发油及其主要组成成分能不同程度地抑制人肝癌BEL-7402细胞的体外增殖及单个细胞形成细胞集落.其中黄樟油素和γ-松油烯对人肝癌BEL-7402细胞的抑制作用强.
关键词： 油樟叶挥发油 Bel-7402细胞 四甲基偶氮唑盐法 人 -
MC3T3-E1细胞与多组分纳米羟基磷灰石基三维复合支架材料的相容性
目的 观察MC3T3-E1细胞在复合支架材料上的黏附、增殖及形态,评价多组分纳米羟基磷灰石基三维复合支架材料的生物相容性.方法 采用仿生学方法,将壳聚糖、羟基磷灰石、明胶、果胶按照一定比例制作成多组分纳米羟基磷灰石基三维复合支架材料.在复合支架材料上接种MC3T3-E1细胞,通过倒置相差显微镜、HE染色、扫描电镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、荧光素二乙酸酯(FDA)及Hoechst33258荧光染色法检测三维复合支架材料的生物相容性.结果 多组分纳米羟基磷灰石基三维复合支架材料呈三维多孔状,MC3T3-E1细胞接种在材料上培养,贴附生长良好,呈多角形或梭形,形态饱满;MTT结果显示,材料组和空白对照组各时间段的吸光度(A)值无统计学意义.结论 多组分纳米羟基磷灰石基三维复合支架材料具有良好的形态结构、理化特性和优越的细胞相容性,是一种很有潜能的骨组织工程材料.
关键词： 壳聚糖 纳米羟基磷灰石 MC3T3-E1细胞 生物相容性 四甲基偶氮唑盐法 -
重组人内抑素对人瘢痕疙瘩成纤维细胞形态及增殖的影响
目的 观察重组人内抑素( rhEndostatin)对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)增殖的影响.方法 体外培养及鉴定人KFs；应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分别检测不同浓度rhEndostatin (6.25 × 10-6、1.25×104、2.50×10-5、5.00×10-5、1.00×10-4mg/L)作用24h、48h、72h后对KFs增殖的影响,并同时观察其形态变化. 结果 组织块接种7～8d后,其周边可见少许梭形细胞,继之细胞逐渐增多并以组织块为中心呈放射状生长；传2代培养的细胞单层排列,形态均一,呈长梭状,折光性好.细胞波形蛋白免疫化学染色显示胞质均呈棕黄色.rhEndostatin(6.25×10-6mg/L浓度组除外)能明显抑制KFs的增殖(P＜0.05),抑制效应与rhEndostatin浓度和作用时间呈一定的依赖关系；其中,5.00×10-5mg/L和1.00 × 10-4mg/L组rhEndostatin作用48 h后,细胞生长缓慢,体积变小,数目减少,排列紊乱. 结论 重组人内抑素对人KFs增殖具有抑制作用.
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MTT、MTS、WST-1在细胞增殖检测中佳实验条件的研究
目的:探讨MTT、MTS、WST-1三种四唑盐在细胞增殖检测中的佳实验条件.方法:取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16细胞,用10%胎牛血清DMEM培养液制成不同浓度的细胞悬液加入96孔培养板中培养24h,分别加入三种试剂后在450nm、492nm和630nm波长处测定OD值,根据不同波长所测OD值的大小确定三种试剂的佳实验波长.根据细胞浓度与OD值关系曲线确定三种试剂各自的适细胞浓度.取适浓度的B16细胞分别加入三种试剂在0.5h、1h、2h和4h四个不同时间点测定吸收值,根据OD值确定佳的检测时间.结果:MTT、MTS法的佳波长为492nm,WST-1法为450nm.MTT的适细胞接种浓度为1.6×103-2.56×104/mL,MTS的适细胞接种浓度为5×10-6.4×103/mL,WST-1的适细胞接种浓度为2.5×10-1.6×103/mL.三种方法的佳测定时间均为4h.结论:MTT、MTS、WST-1分别适用于不同条件下检测细胞的存活与增殖,可为抗病毒及抗癌药物的筛选提供实验依据.
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4种细胞毒活性方法评价紫草素体外肿瘤细胞抑制作用效果
目的 研究4种细胞毒活性测定方法 对紫草素体外肿瘤细胞抑制作用的评价效果,对紫草萘醌为代表的天然色素在细胞毒活性评价中常出现的假阴性现象进行对比分析.方法 将紫草素与其高敏感株急性早幼粒白血病HL-60细胞和低敏感株人非小细胞肺癌A549细胞体外共培养,通过台盼蓝法、磺酰罗丹明B(SRB)法、Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法和四甲基偶氮唑盐(MTT)法进行平行实验,测定紫草素在0.4～128 μmol/L抑制细胞生长的量效关系曲线.结果 台盼蓝法、SRB法、CCK-8法、MTT法测得紫草素对HL-60细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.57、0.77、1.36、1.01 μmol/L,对A549细胞的IC50分别为6.30、10.38、13.48、15.24 μmol/L,.紫草素浓度分别在3.2、32 μmol/L以下时,4种检测方法得到其对2种细胞的抑制率均呈线性增长,超过此浓度即出现差异.其中台盼蓝法与SRB法结果一致性良好,而MTT法与CCK-8法测得的抑制率较低.对于HL-60细胞,紫草素12.8 μmol/L时,CCK-8测得抑制率为81％,台盼蓝法为96％;对于A549细胞,紫草素128 μmol/L时,MTT法测得抑制率为89％,台盼蓝法为99％.紫草素的吸收光谱与甲臜在波长400～600nm存在重叠,大重叠峰在550～570 nm,CCK-8试剂与紫草素对HL-60细胞存在协同抑制效应.台盼蓝法结果显示高浓度紫草素几乎完全杀死板孔内细胞,相比对照组差异显著,但MTT法和CCK-8法结果出现假阴性.结论 紫草萘醌为代表的天然色素的细胞毒活性评价不建议使用MTT法和CCK-8法,推荐使用SRB法和台盼蓝法.
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组织激肽释放酶1转染骨髓间充质干细胞的病毒感染复数选择
背景：血管舒缓素即组织激肽释放酶1，是组织激肽释放酶-激肽系统重要组成部分之一。有研究表明血管舒缓素通过促进血管新生，抑制心肌炎症产生等发挥其对心血管系统的保护作用，但并未从干细胞诱导分化方面进行探讨。目的：实验利用已构建的腺病毒载体，将其携带的血管舒缓素基因转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，观察其是否成功转染及转染率如何。方法：以腺病毒作为载体，将目的基因血管舒缓素转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，并采用荧光显微镜、四甲基偶氮唑盐法和流式细胞技术观察病毒对细胞的转染效果，以确定佳的病毒感染复数。结果与结论：荧光显微镜下观察到腺病毒携带的血管舒缓素目的基因成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上；流式细胞仪结果显示转染率跟病毒感染复数值的大小有关系，当病毒感染复数为150时，转染率为80.8%；四甲基偶氮唑盐法结果提示，病毒感染复数为200时，细胞生长受到明显的抑制。结果证实，腺病毒介导的血管舒缓素能成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，且佳的病毒感染复数为150。
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雷公藤甲素对人晶状体上皮细胞生长影响的实验研究
目的 研究雷公藤甲素(Triptolide,Tri)对人晶状体上皮细胞(Human Lens Epithelial Cells,HLEC)增殖抑制作用.方法 原代培养人品状体上皮细胞,Tri不同浓度、不同作用时间后吖啶橙试剂(AO)染色,荧光显微镜下观察细胞核的形态变化;MTT法测定人晶状体上皮细胞增殖抑制率.结果 雷公藤甲素对细胞的生长有明显的抑制作用,且呈浓度时间依赖性.结论 一定剂量的Tri可抑制体外培养的人晶状体上皮细胞的增殖,为预防后囊混浊提供了新途径.
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野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2在E. Coli中的表达和纯化研究
目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因在E.coli重组表达,纯化重组SEC2(rSEC2)并进行生物学活性分析.方法 PCR获得正确编码SEC2的基因片断,构建表达质粒pET -28a-sec2在E.coli BL21中表达.利用离子交换和分子筛色谱纯化rSEC2,四甲基偶氮唑盐(MTT)法对rSEC2和天然SEC2(nSEC2)生物学活性进行分析和比较.结果 可溶性rSEC2占菌体总蛋白质的40%,两步纯化后蛋白质纯度约达9 5%,rSEC2和nSEC2均具有显著的超抗原活性.结论 成功获得与nSEC2有着类似活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白质的抗肿瘤机理奠定物质基础.
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MTT法测定脑胶质瘤化疗药物的体外敏感性
目的 探讨运用四甲基偶氮唑盐(MYr)法测定脑胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性.方法 采用MTT法对32例脑胶质瘤新鲜标本进行了4种脑肿瘤常用化疗药物的体外敏感性测定.结果 4种化疗药物在血浆峰浓度下的敏感度分别为顺铂(DDP)53.1%、长春新碱(VCR)40.6%、尼莫司汀(ACNU)31.4%、替尼泊甙(VM-26)15.6%.DDP与VCR的敏感度差异无统计学意义(P＞0.05),但两者敏感度明显高于ACNU和VM-26(P＜0.05).结论 MTT法检测脑胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性有助于指导临床对术后患者进行个体化化疗.
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谷氨酸受体拮抗剂对培养大鼠海马神经元活力的影响
目的:观察N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂卓西平马来酸盐、艾芬地尔、CGP-37849、L-701.324、HA-966和AMPA受体拮抗剂NBQX分别对培养大鼠海马神经元细胞活力的影响.方法:取孕18天的SD胎鼠海马神经元细胞原代培养,培养的细胞在加入上述药物后,在培养第2天和第7天行台盼蓝染色观察细胞存活情况,四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡.结果:各浓度的卓西平马来酸盐对培养大鼠海马神经元活力均产生显著毒性.高浓度艾芬地尔和L-701.324可诱导细胞产生凋亡,而低浓度则没有显著作用.各浓度的CGP-37849、NBQX和HA-966对细胞存活无显著影响.结论:只有非选择性NMDA阻断剂MK-801,可降低大鼠海马神经元细胞活力并诱导其凋亡.
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人参皂苷Rg1对培养猪骨髓基质细胞增殖的影响
人参为中医传统"补气生血"药物,人参皂苷单体Rg1是人参三醇组皂苷的一个代表性单体,被认为是其主要药物成分,对心血管、神经系统及免疫功能等具有广泛的药理作用[1,2].既往的研究表明,人参总苷对体外培养的骨髓造血干细胞及祖细胞有增殖作用,对骨髓造血因子具有促分泌作用[3,4],但对骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)的增殖作用研究较少.为此,应用CFU-F形成法、[3H]TdR参入法和MTT法研究人参皂苷Rg1对BMSC体外生长及其增殖的影响.
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非小细胞肺癌ERCC1的表达与铂类药物耐药关系的研究进展
化疗是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的主要治疗方法之一,在众多的化疗药物中,铂类药物的有效率已被大家所认可,但随着临床使用频率的增加,其耐药性亦逐渐显现.铂类药物耐药机制很复杂,其中核苷酸切除修复系统(nucleotide excision repair,NER)修复能力增强是耐药发生的主要原因之一,而切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementation groupl,ERCC1)是NER家族的重要成员之一.近年来NSCLC组织中ERCC1的表达与铂类药物耐药的关系已逐渐受到重视,相关的临床研究和基础研究均有一定的进展.
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大豆苷元对HEC-1B细胞增殖及雌激素受体报告基因表达的影响
目的 探讨大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响及其对雌激素受体报告基因表达的影响.方法 体外培养子宫内膜癌细胞子宫内膜癌雌、孕激素受体阴性细胞系(HEC-1B),采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测不同浓度大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响,同时检测大豆苷元对雌激素应答原件(ERE)调控的雌激素受体α(Erα)和雌激素受体β(Erβ)的荧光素酶报告基因表达的影响.结果 大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖有明显抑制作用,差异有统计学意义(P＜0.01),其抑制作用有明显量效和时效性特征.在浓度为20～80×10-6mol/L的大豆苷元作用下,报告基因luc的表达较正常对照组明显提高,差异有统计学意义(P＜0.05),在80×10-6mol/L时到达高值;大豆苷元通过ERB介导的报告基因表达水平的升高程度强于Erα,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 大豆苷元可通过调节子宫内膜癌细胞Erα和Erβ介导的报告基因的表达,调整Erα/Erβ比例,从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖.
